Deklaracje microbiome – friendly – ich zasadność i metody potwierdzania

To, czy kosmetyki i produkty oddziałują na mikrobiom jest przedmiotem coraz większej ilości badań. Zaczyna się również pojawiać pytanie, czy aby na pewno wywieranie wpływu na bytujące na skórze mikroorganizmy w ogóle powinno być pożądane. A może lepszym wyjściem jest sytuacja, gdy używane produkty jednak takiego oddziaływania nie wykazują?

Co wiemy o mikrobiomie skóry?

Mikroflorę skóry można z grubsza podzielić na dwie grupy: florę stałą i przejściową. Do flory stałej należą gatunki saprofityczne i patogenne, takie jak S.aureus, E.coli, P.aeruginosa i bakterie z rodzaju Bacillus. Do grupy mikroorganizmów flory przejściowej należą i gatunki patogenne i komensalne, m.in. Proteobacteria, S.hominis, Propionibacterium, Corynebacterium, Dermabacter, Brevibacterium, Micrococcus, Pityrosporum, Malassezia. Stan mikroflory skóry, który może liczyć nawet ponad 1000 gatunków, zależy od temperatury, wilgotności, pH skóry, od wpływu promieniowania, poziomu hormonów, obecności składników odżywczych, genów, diety i stylu życia. I tak, jak nasza skóra zmienia się wraz z wiekiem, tak samo zmienia się i jej mikrobiom. Można nawet powiedzieć, że mikrobiom skóry każdej osoby jest jak jej specyficzny odcisk palca – względnie stała w ciągu życia, a jednocześnie na tyle różna od innych osób, że pozwala na rozróżnienie osobnicze.

Odzwierciedleniem zdrowej skóry jest zróżnicowana, ale pozostająca pod wzajemną kontrolą, mikroflora skórna. Mikroorganizmy żyjące na niej w homeostazie pozwalają na utrzymywanie takiego stanu rzeczy. Jednak czasem wystarczy zmniejszenie liczebności tylko jednego z bytujących "pożytecznych" gatunków, by inny, potencjalnie patogenny gatunek urósł w siłę i pozwolił na pojawienie się problemów, takich jak trądzik, atopowe zapalenie skóry, łuszczyca czy łupież. Jednocześnie olbrzymia zmienność mikrobiomu, zarówno ilościowa, jak i jakościowa, sprawia, że nie ma jedynej poprawnej odpowiedzi na pytanie, jaki powinien być "dobry mikrobiom".

Naukowcy odkryli, że komórki skóry, odpornościowe i bakteryjne pozostają ze sobą w komunikacji. Interakcje te przejawiają się m.in. w funkcjonowaniu bariery skórnej, ograniczeniu TEWL i ochronie przed infekcjami. Jednak pełne zrozumienie wszystkich zależności pozostaje nadal w obszarze intensywnych badań.

Pre-, pro- i postbiotyki

Terminologia pro-, pre- i postbiotyków w kontekście kosmetyków nie jest uregulowana. Polegając na definicji wywodzącej się z przemysłu spożywczego, probiotykami powinny być nazwane żywe mikroorganizmy, które dostarczone w odpowiedniej ilości, dają efekt zdrowotny dla gospodarza. Często nie jest możliwe proste przeniesienie tej definicji na kosmetyki, chociażby dlatego, że nie znamy dokładnie mechanizmów rządzących oddziaływaniami mikrobiom – skóra. "Efekt zdrowotny" powinien być  w tej definicji również zamieniony na "efekt kosmetyczny" lub oddziaływanie na mikrobiom skóry. ICCR (International Cooperation on Cosmetics Regulation) w swoim dokumencie w 2022 r. proponuje podzielić wspomniane składniki według żywotności. I tak żywe (lub uśpione, czyli pozbawione możliwości wzrostu, ale zachowujące aktywność metaboliczną) bakterie można określać jako probiotyki, a do nieżywotnych składników będą zaliczane prebiotyki (substancje odżywcze dla "dobrych" mikroorganizmów) i postbiotyki. Do postbiotyków zalicza się lizaty, fermenty, ekstrakty komórkowe, inaktywowane bakterie oraz produkty metabolizmu i substancje wydzielane przez mikroorganizmy, np. kwas mlekowy czy ektoinę.

Produkty z probiotykami, tak jak każdy inny kosmetyk, muszą spełniać wymagania co do czystości mikrobiologicznej, a szczepy probiotyków powinny być odróżnialne od potencjalnych zanieczyszczeń i posiadać profil bezpieczeństwa świadczący o ich nietoksyczności. Zagadnieniami, z którymi trzeba zmierzyć się podczas projektowania kosmetyku probiotycznego, są nie tylko rodzaj bakterii, ale również ich ilość. Nawet jeśli dany mikroorganizm jest częścią "dobrej" mikroflory skóry, obecny w złej proporcji może spowodować zachwianie równowagi.

Niektórzy zastanawiają się, czy probiotyki w ogóle powinny być traktowane jako składniki kosmetyczne. Według rozporządzenia 1223/2009 produkt kosmetyczny jest "substancją lub mieszaniną", gdzie przez substancję rozumie się pierwiastek chemiczny i jego związki. Probiotyk, rozumiany jako żywe komórki, nie spełnia tej definicji, ale nie jest też zakazany do użycia. Wprowadza to niejasność regulacyjną i kwalifikacyjną. Pojawiające się deklaracje mówiące o wpływie produktu na mikrobiom, mogą być traktowane jako modyfikowanie funkcji organizmu (jeśli uznamy mikrobiom za część organizmu), co jest niedozwolonym działaniem produktów kosmetycznych.  Podobnie jak sugerowanie działania leczącego, np. trądzik, co do którego wiemy, że związany jest z dysbiozą mikrobiomu.

Wpływ kosmetyków na mikrobiom oczami konsumenta

Czy konsument i technolog postrzegają wpływ kosmetyków na mikrobiom skóry tak samo? W 2021 roku jedna z topowych marek kosmetycznych opublikowała wyniki badania konsumenckiego dotyczącego postrzegania kosmetyków i ich wpływu mikrobiomu skóry. Okazało się, że klienci myślą, że głównymi zaletami kosmetyków z probiotykami są – równoważenie pH skóry, zabijanie szkodliwych (tych, które wywołują trądzik lub inne zmiany) bakterii na skórze, balansowanie mikrobiomu. Uważali oni także, że "dobre bakterie" probiotyczne "walczą" ze "złymi bakteriami" na skórze i tworzą ochronną warstwę na powierzchni naskórka.

Deklaracje związane z mikrobiomem

Zagadnienia związane z mikrobiomem skóry są wciąż "młodym", stale rozwijającym się obszarem badań. Okazuje się, że styl życia oddziałuje na mikrobiom tak samo silnie, jak predyspozycje genetyczne. Mimo to pojawia się wiele deklaracji sugerujących coś, czego w tym momencie nie jesteśmy naukowo pewni. Na rynku kosmetycznym obecnych jest coraz więcej produktów, które obiecują zdrowszą skórę poprzez oddziaływanie na mikrobiom. Niestety zdarza się także, że marketing deklaruje rzeczy, które nie mają umocowania naukowego ani poparcia badaniami.

Kosmetyki nie mogą leczyć czy czynić zdrową skóry, stąd należy uważnie dobierać deklaracje, które także są częścią prezentacji produktu, wpływającą na jego klasyfikację. Wspieranie i ochrona mikrobiomu są dopuszczalne, ale twierdzenie, że produkt stymuluje, wzmacnia mikrobiom nie powinny być stosowane. Kosmetyki przyjazne dla mikrobiomu nie powinny wpływać na równowagę skóra – jej mikroflora, a już tym bardziej na różnorodność gatunków.

Deklaracja mówiąca o pozytywnym wpływie na mikrobiom wymaga silnych dowodów na potwierdzenie. Podobnie stwierdzenie, że produkt wpływa na równowagę mikrobiomu, na gruncie rzetelności wymagałoby przeprowadzenia badań na wielu probantach i wykazanie, że przywraca on i utrzymuje balans na poziomie, który jest zdrowy dla konkretnej osoby. Nie istnieje jeden zdrowy mikrobiom skóry, gdyż jest to cecha indywidualna. Badania dotyczące równoważenia mikrobiomu powinny obejmować wiele (nawet setki) osób oraz obejmować nie tylko naskórek, ale także pozostałe warstwy skóry i ujścia gruczołów. Ich wyniki powinny odnosić się do tego, co oznacza "zdrowy" dla każdego z uczestników. Deklaracja o balansowaniu mikrobiomu jest jednak częsta, a nie wydaje się, by zawsze była rzetelnie udowodniona.

Jedną z kategorii deklaracji mikrobiomowych jest pokazywanie, że produkt nie zawiera pewnych składników, np. SLS, substancji zapachowych lub pewnych konserwantów, i tylko na tej podstawie stwierdzanie, że produkty są delikatne dla mikrobiomu. Jest to postępowanie niezgodne z zasadą uczciwości tworzenia twierdzeń o produktach kosmetycznych (dokument techniczny 655/2013). Podobnie samo dodanie do kosmetyku pre- lub postbiotyku nie gwarantuje jeszcze, że produkt będzie przyjazny dla mikrobiomu.

Innym ważnym zagadnieniem, które należy rozważyć przy tworzeniu deklaracji microbiome – friendly, jest to, czy mikrobiom jest częścią ciała, a zatem wpływanie na mikrobiom jest wpływaniem na fizjologię ciała. Pozytywna odpowiedź sprawiłaby, że taki produkt nie spełniałby definicji kosmetyku. Do tej pory nie ustalono wyraźnej linii podziału na kosmetyki przyjazne dla mikrobiomu a produkty medyczne.

Deklaracje wychodząc ponad bycie "przyjaznym dla mikrobiomu" są trudne do udowodnienia ze względu na stopień skomplikowania zagadnienia. Duża zmienność międzyosobnicza i liczne, nie do końca poznane powiązania pomiędzy różnorodnością mikroflory i jej wzajemnymi oddziaływaniami sprawiają, że potwierdzenie efektywnego działania jest wyzwaniem. Nie ma jednej, poprawnej drogi, którą można potwierdzić daną deklarację związaną z mikrobiomem. Dużo zależy od wybranej metody badań i protokołu ich przeprowadzania, a także umiejętności interpretacji wyników.

Planowanie badań dla produktu mającego wpływać na mikrobiom

Z punktu widzenia mikrobiomu skóry, lepiej, gdy produkt na niego nie oddziałuje, gdyż każda aktywność może być potencjalnie szkodliwa. Jest to niejako odwrócenie paradygmatu, gdzie w kosmetykach stawia się na te najefektywniejsze substancje aktywne. Planując badania dla kosmetyku, który ma wpływać na mikrobiom, warto przyjąć na samym początku dwa założenia:

– nie istnieje coś takiego jak idealny mikrobiom skóry, ponieważ będzie on różnił się znacząco w zależności od cech osobniczych, miejsca i stylu życia,

– mikrobiom skóry nie jest tak łatwo mierzalnym parametrem, jak wielkość zmarszczek, rozmiar porów czy stopień nawilżenia, więc związane z nim badania są trudniejsze do przekucia w deklarację.

Naukowcy są zgodni, że duża różnorodność mikrobiomu sprzyja zachowaniu zdrowej, poprawnie funkcjonującej skóry. Bakterie syntetyzują i wydzielają wiele różnych substancji, które mają znaczący wpływ na aktywność metaboliczną komórek skóry. Ogólnie można by powiedzieć, że kosmetyki powinny zmniejszać ilość "złych" bakterii i wspierać te "dobre". Utrudnieniem jest jednak fakt, że "złe" i "dobre" są pojęciem względnym, w zależności od stanu skóry. Mikrobiom skóry wyraźnie różni się w zależności od partii ciała, stąd wybierając gatunki bakterii do badań oraz ich metodykę, warto dostosować się do charakterystyki miejsca docelowej aplikacji kosmetyku. Badania dla produktu przeznaczonego do skóry twarzy powinny różnić się od badań dla produktu do skóry głowy czy sfery intymnej. Bardzo pomoce w zrozumieniu tego, jak gotowy produkt wpływa na mikrobiom, mogą okazać się cząstkowe wyniki z podobnych badań dla surowców.

Zróżnicowane metodologie badań mikrobiomu i ich sprawozdawczość sprawiają, że ich replikacja i ocena jakości są trudne. Być może przyszłością badań mikrobiomu skóry nie są badania samych mikroorganizmów, ale analiza ich metabolitów? Dane z takich badań mogą stanowić cenne źródło informacji.

Kłopoty z nieprecyzyjnymi deklaracjami

Dwie znane marki kosmetyczne musiały wycofać się ze swoich deklaracji "mikrobiomowych", gdyż nie miały one rzetelnego potwierdzenia. W 2019 w Wielkiej Brytanii zakazano publikacji reklamy produktu dla niemowląt, w której padało zdanie: "Każde dziecko rodzi się z unikalnym mikrobiomem, żywą warstwą, która chroni skórę, odżyw ją z naszym produktem" oraz pojawiło się odniesienie do zawartości prebiotyku. Powodem zakazu było to, że stwierdzenie o odżywianiu mikrobiomu może wprowadzać konsumenta w błąd, a przedstawione przez producenta badania potwierdzające nie zostały uznane za wystarczające. Z kolei w 2021 roku w USA producent otrzymał pozew zbiorowy za wprowadzanie w błąd deklaracją o  zawartości w kremie do twarzy probiotyku, który przeciętny konsument rozumie jako żywe bakterie. W składzie produktu żywych bakterii nie było.

Badania in vitro

Podstawowymi badaniami mikrobiomu skóry pozostają badania in vitro. Na podstawie badań naukowych obecnie jesteśmy już w stanie wyselekcjonować kluczowe gatunki bakterii dla poszczególnych obszarów skóry (np. suchych, tłustych, wilgotnych lub twarzy, skóry głowy, strefy intymnej).  Testy przeprowadza się więc na tych wybranych gatunkach, pojedynczo lub w złożonych zawiesinach, najczęściej posługując się protokołami wyznaczania MIC (minimalnego stężenia hamującego).  Badania in vitro są stosunkowo proste do przeprowadzenia i  łatwo standaryzowane, dzięki kontrolowanym warunkom eksperymentów. Jeśli produkt nie wykazuje żadnego efektu w takich prostych testach, to prawdopodobieństwo, że produkt nie będzie naruszał mikrobiomu skóry, jest wysokie.

Z mikrobiologicznego punktu widzenia, kiedy przeprowadzamy test in vitro, to mamy bezpośredni kontakt produktu z mikroorganizmami, i jeśli w takiej sytuacji nic się nie stanie, to bardzo prawdopodobnym jest, że na skórze również nie zadzieje się nic znaczącego. Testy in vitro upraszczają sytuację mikrobiom – produkt, ale w wielu przypadkach, do potwierdzenia deklaracji jest to rozwiązanie wystarczające. Badania in vivo są z pewnością bardzo cenne, szczególnie w perspektywie długotrwałego oddziaływania, ale ze względu na stopień skomplikowania i interpretacji wyników oraz wymóg specjalistycznego zaplecza badawczego, nie zawsze są dla firm osiągalne.

Badania in vivo

Badania in vivo polegają na pobraniu materiału do analizy ze skóry probantów. Krytycznym momentem testowania jest pobieranie wymazów, ponieważ jest to zadanie obarczone potencjalnie dużym błędem, ze względu na czynnik ludzki. Protokoły badań in vivo powinny ściśle opisywać sposób, miejsce i czas pobierania próbek (ze strefy z badanym produktem, ze strefy placebo, ze strefy bez traktowania żadnym produktem, przed i po użyciu produktu). Różnice w wynikach mogą być bowiem rezultatem różnego sprzętu (rozmiar i rodzaj wymazówki), wielkości miejsca pobrania próbki oraz jego lokalizacji na ciele, a nawet od interpersonalnych różnic pomiędzy personelem w zakresie siły nacisku, czasu i sposobu pobierania wymazu.

Wymazy są  jednak przede wszystkim szybką i nieinwazyjną metodą pobierania próbek do badań. Po niej w dalszej kolejności badań in vivo, następuje ekstrakcja materiału genetycznego z pobranej próbki oraz jego amplifikacja, sekwencjonowanie i analiza, najczęściej w obszarze 16s-rRNA (badania porównawcze). Dzięki temu można ocenić ilość i jakość gatunków mikroorganizmów z pobranej próbki, czyli różnorodność mikroflory. Przyjmuje się, że większa różnorodność związana jest z mikrobiomem będącym w homeostazie i  poprawnie funkcjonującą skórą.  Rozróżnia się także dwa typy różnorodności – alfa i beta. Różnorodność alfa odnosi się do konkretnej próbki lub miejsca i opisuje lokalną różnorodność gatunków, a różnorodność beta dotyczy próbek z różnych lokalizacji – daje informacje, jak dwie społeczności są do siebie podobne lub nie. Podczas badań mierzy się nie tylko liczbę mikroorganizmów w próbce, ale także ich dystrybucję (równomierność rozkładu).

Podczas opracowywania metodologii badań in vivo, oprócz określenia liczebności grupy testowej, ważna jest także charakteryzacja grupy badawczej, pod względem co najmniej płci, wieku i stylu życia. Nie można zapominać o próbie kontrolnej.

Inne metody badań mikrobiomu

Nieinwazyjnym badaniem, które można wykorzystać w testowaniu produktów przeciwtrądzikowych jest  identyfikacja C.acnes na powierzchni skóry (in vivo) z wykorzystaniem urządzenia Visiopor® PP 34N (Courage+Khazaka electronic GmbH). Jest to kamera, która używa światła UV o specyficznej długości fali, dzięki czemu można zobrazować zmiany trądzikowe. C.acnes, które kolonizują zmiany trądzikowe, produkują m.in. porfiryny, które widoczne są w kamerze dzięki pomarańczowo-czerwonej fluorescencji (po wzbudzeniu światłem UV). Intensywność rejestrowanego światła jest proporcjonalna do ilości porfiryn, a więc i ilości C.acnes.

Przydatną metodą do śledzenia zmian w liczebności głównych gatunków (lub genów) jest pomiar ilości bakterii za pomocą qPCR. Może ona dać odpowiedź na pytanie, czy dany produkt wpływa (lub nie) na dany gatunek bakterii.

Badania porównawcze "shotgun proteomics", wykorzystujące LC-MS/MS oraz narzędzia bioinformatyczne i biostatystyczne, pozwalają na analizę taksonomiczną bakterii. Identyfikuje się, jakie bakterie można znaleźć w danym miejscu lub próbce, a następnie analizuje się ich genom, aby lepiej poznać ich działanie. Badania takie mogą dać odpowiedź na to, jak dany produkt wpływa na wzajemne interakcje gospodarz – mikrobiom. Aby jednak otrzymane dane przełożyć na zrozumiałą deklarację, koniecznym jest, aby laboratorium posiadało odpowiednie doświadczenie w tego typu analizach oraz dostęp do odpowiednich baz bioinformatycznych, ponieważ nie są to badania łatwe do interpretacji.

Wykorzystując modele skóry 3D (badania in vitro), można sprawdzać, w jaki sposób jest kolonizowana skóra danym gatunkiem (lub zwykle maksymalnie trzema gatunkami) bakterii. Model można dostosować do specyfiki produktu, przeprowadzić badania porównawcze (jak zmienia się szybkość i sposób kolonizacji) dla badanego produktu i placebo (lub w sytuacji braku jakiejkolwiek ingerencji produktem). Pytaniem otwartym jest, czy wyniki dla ograniczonej liczby gatunków można przenosić na cały mikrobiom.

Certyfikacja

W Europie istnieją dwa certyfi aty związane z oddziaływaniem kosmetyków i surowców na mikrobiom skóry, są to Safe Microbiome oraz MyMicrobiome – „microbiome friendly”. Warto wspomnieć, że Safe Microbiome jest rodzimą inicjatywą opracowaną w Centrum Badań i Innowacji dr Nowaczyk. W obu proces certyfi kacji obejmuje kilka badań: po pierwsze czystości mikrobiologicznej, następnie badania in vitro na wybranych szczepach bakteryjnych, a w przypadku Safe Microbiome dodatkowo testy in vivo na ochotnikach. W certyfikacie MyMicrobiome sprawdzany jest wpływ produktu na wspólną hodowlę S.epidermidis i S.aureus – nie może on naruszać balansu na korzyść S.aureus, natomiast w Safe Microbiome badana jest żywotność S.epidermidis. W następnym kroku w obu standardach badania wykonuje się na wyselekcjonowanej grupie mikroorganizmów, która jest charakterystyczna dla danej partii ciała. Istnieją więc osobne protokoły dla produktów, które mają być używane m.in. na twarzy, ciele, skórze głowy, okolicach intymnych, jamie ustnej lub nosowej, a także skórze niemowląt i dzieci (w przypadku Safe Microbiome z oczywistych względów etycznych dla tego przypadku nie wykonuje się badań na ochotnikach). Zgodnie z certyfikatem MyMicrobiome, produkt można określać jako „microbiome-friendly”, jeśli poszczególne testy wykażą pozytywny (lub brak negatywnego) wpływu na mikrobiom w warunkach laboratoryjnych. Certyfikat Safe Microbiome daje natomiast dalszą możliwość poznania interakcji produkt – mikrobiom ochotnika, a więc jest próbą odzwierciedlenia sytuacji stosowania w codziennym życiu. Wspomniane certyfikaty pozwalają na używanie deklaracji takich jak: szanuje równowagę mikrobiomu, czy jest łagodny dla mikrobiomu.

Podsumowanie

Potwierdzanie deklaracji odnoszących się do wpływu produktu na mikrobiom skóry jest trudnym zadaniem. Brak odgórnych definicji probiotyków, ciągle rosnąca ilość informacji na temat oddziaływania mikroorganizmów na skórę i wiele możliwości badawczych sprawiają, że ważnym jest odpowiednie formułowanie oświadczeń.

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Kosmetycznego" 1/2023