„Burkholderia cepacia – wciąż aktualne zagrożenie surowców i produktów kosmetycznych”

Kontaminacja gotowego produktu kosmetycznego może być spowodowana zarówno niską jakością używanych surowców, jak i niewystarczającą higieną środowiska produkcji. Aby zapobiec zagrożeniom wynikającym z zanieczyszczenia mikrobiologicznego na etapie wytwarzania, producenci kosmetyków stosują odpowiednie zasady postepowania zebrane w przewodnikach takich jak PN – EN ISO 22716:2009 – Kosmetyki Dobre Praktyki Produkcji (GMP) – Przewodnik Dobrych Praktyk produkcji [19]. Innym ważnym narzędziem w walce z ryzykiem zanieczyszczenia mikrobiologicznego jest odpowiedni dodatek środków konserwujących do formulacji produktu oraz nowoczesne opakowania zapobiegające przedostawaniu się drobnoustrojów do kosmetyku podczas użytkowania.

Należy przyznać, że wiedza na temat niebezpieczeństw związanych z mikrobiologicznym zanieczyszczeniem kosmetyków jest coraz rozleglejsza. Mimo to, w przeciągu ostatnich pięciu lat zanotowano 36 zgłoszeń do systemu RAPEX produktów kosmetycznych wycofanych z rynku ze względu na ryzyko mikrobiologiczne [8]. W większości przypadków powodem wycofania było zanieczyszczenie mezofilnymi drobnoustrojami tlenowymi (potoczna nazwa: ogólna liczba drobnoustrojów – OLD). W dziewięciu przypadkach oprócz przekroczenia ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych, wykryto również obecność pleśni i drożdży, a w ośmiu bakterii z rodzaju Pseudomonas sp. w tym P. putida i P.aeromonas. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) był powodem zgłoszenia jednego produktu – chusteczek nawilżanych dla niemowląt wyprodukowanych w Polsce (zgłoszenie Estonia). Drobnoustroje niespecyficzne scharakteryzowano tylko w sześciu produktach, w których zanotowano wysoką liczbę mezofilnych drobnoustrojów tlenowych – w jednym przypadku była to Burkholderia cepacia wykryta w żelu do kąpieli i pod prysznic dla dzieci, pochodzącego z Chin. W pozostałych przypadkach zidentyfikowano takie gatunki jak Pseudomonas stutzeri, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, Enterobacter micina i Pluralibacter gergoviae. Trzeba podkreślić, że powyższe dane nie dają pełnego rozeznania
co do gatunków drobnoustrojów niespecyficznych będących przyczyną zanieczyszczenia kosmetyków. Obraz byłby znacznie pełniejszy, gdyby dokonano pełnej charakterystyki gatunkowej tlenowych bakterii mezofilnych występujących w wycofanych produktach.

Na podstawie danych literaturowych z okresu ostatnich dwudziestu lat można zauważyć powtarzające się przypadki izolowania z produktów kosmetycznych oraz leczniczych bakterii z rodzaju Burkholderia sp. z grupy Burkholderia cepacia complex (Bcc), co potwierdzają również wyniki badań własnych. Tego rodzaju zanieczyszczenie wykryto w płynie do płukania jamy ustnej, w mleczku do ciała, kremach nawilżających, pastach do zębów oraz w mydle w płynie [1,13,14,18].

Burkholderia cepacia (pierwotnie Pseudomonas cepacia) po raz pierwszy została opisana w 1981 r., a jedenaście lat później dzięki dokładnej analizie filogenetycznej, zakwalifikowano ten drobnoustrój do rodziny Burkholderiaceae i nadano mu nazwę gatunkową Burkholderia cepacia. Aktualną systematykę B. cepacia przedstawiono w tab. 1 [4].

Dokładna identyfikacja molekularna wykazała, że B. cepacia jest bardzo blisko spokrewniona z innymi pałeczkami należącymi do rodzaju Burkholderia sp., dlatego też została stworzona grupa Burkholderia cepacia complex (Bcc) do której należy 18 gatunków niewykazujących różnic fenotypowych [12]. Ich identyfikację gatunkową wykonuje się wyłącznie przy pomocy technik molekularnych oraz spektrometrii mas [10].

B. cepacia jest tlenową, nieprzetrwalnikującą, niefermentującą, Gram-ujemną pałeczką, prostą lub lekko zakrzywioną. Osiąga wymiary od 1 do 5 μm długości i 0,5 – 1,0 μm szerokości. Posiada jedną lub kilka wici ułożonych polarnie, dzięki czemu wykazuje zdolność do ruchu (w obrębie rodzaju Burkholderia sp. tylko B. mallei jest nieruchliwa). Jest katalazo – dodatnia oraz oksydazo-dodatnia, gamma hemolizująca [21]. Minimalna aktywność wody (Aw) niezbędna do jej wzrostu wynosi 0,95 [3], co potwierdzają również wyniki badań własnych.

B. cepacia oryginalnie izolowana była z bulw cebuli, w których powodowała gnicie. Mikroorganizm ten naturalnie występuje również w wilgotnym środowisku i na wilgotnych powierzchniach. Obecny jest w glebie, jak i w wodzie. Znajdowany był jako endofit również w tkankach roślin takich jak np. cytrusy czy rośliny korzeniowe, dlatego może stanowić składnik mikroflory surowców stosowanych w przemyśle kosmetycznym [3].

Drobnoustroje należące do grupy Burkholderia cepacia complex (Bcc) wykazują naturalną oporność na antybiotyki z grupy polimyksyn (polimyksyna B i kolistyna), jak również oporność nabytą na wiele grup antybiotyków i chemioterapeutyków [17]. Badania nad szczepami izolowanymi z kosmetyków wykazały wzrastającą oporność na antybiotyki β – laktamowe, chinolony, rifampicynę i tetracyklinę [17].

Dzięki zdolności do biologicznej degradacji ksenobiotyków Burkholderia cepacia jest odporna na niektóre środki dezynfekcyjne stosowane powszechnie w szpitalach, zakładach produkcyjnych czy Jakość i bezpieczeństwoch, jak i na działanie środków ochrony roślin należących do pestycydów [11]. W USA, United States Environmental protection Agency (EPA) zarejestrowało produkty na bazie pestycydów zawierające szczególny szczep B. cepacia, który dzięki bardzo szybkiemu wzrostowi zapobiega porażeniu grzybami nasion kukurydzy, fasoli czy bulw ziemniaków. Jednak mimo następującemu dość szybko spadkowi liczby B. cepacia w samej roślinie, stosowanie takich preparatów może powodować zagrożenie uwalniania dużej liczby tej bakterii do środowiska.

Najnowsze badania z 2020 roku [15] wykazały również wpływ B. cepacia na układy konserwujące produktów kosmetycznych przeznaczonych do ochrony przeciwsłonecznej (SPF). Wyniki badań dowiodły, że bakteria ta mając zdolność wytwarzania enzymu esterazy, prowadzi skomplikowane szlaki metaboliczne, których produkty ostatecznie znoszą działanie układów konserwujących w kosmetykach z filtrami przeciwsłonecznymi. Ponadto wykazano, że niektóre filtry UV mogą być źródłem oporności wytworzonej przez B. cepacia, czyniąc tę bakterię bardziej niebezpieczną dla zdrowia ludzi.

Wszystkie wyżej wymienione cechy B. cepacia complex powodują, że bakterie należące do tej grupy są groźnymi patogenami szczególnie dla pacjentów chorych na mukowiscydozę i z obniżoną odpornością. Przypadki ognisk epidemiologicznych oraz zakażeń szpitalnych na oddziałach leczących chorych na mukowiscydozę występują na całym świecie [6,26]. W badaniach przeprowadzonych w zakładzie Mikrobiologii IGiChP w Warszawie wprawdzie patogen ten rzadko izolowano od chorych na mukowiscydozę, jednak jego obecność uznano za niekorzystny czynnik rokowniczy związany z pogorszeniem funkcji płuc [9].

Burcholderia cepacia complex może być również przyczyną przewlekłej choroby ziarniniakowej lub chorób układu moczowego u cewnikowanych pacjentów, a także może powodować bakteriemię u osób z obniżoną odpornością i zapalenie wsierdzia [7].

Z punktu widzenia technologii wytwarzania kosmetyków bardzo ważną cechą tego drobnoustroju jest zdolność do tworzenia biofilmu. B. cepacia potrafi przetrwać kilka miesięcy w wodzie i pozostać zdolna do wzrostu w warunkach, w których dostępna jest tylko niewielka ilość substancji odżywczych. Badania prowadzone na Politechnice Łódzkiej [24] wykazały, że B. cepacia ma właściwości adhezyjne w stosunku do powierzchni polimerowych. Wytwarza biofilm (6.5 log CFU cm2) na powierzchniach PCV i kopolimeru styren-akronitryl. Tworzenie się biofimu obserwowano już po 12 godzinach. Biorąc pod uwagę odporność na środki dezynfekcyjne oraz zdolność do wzrostu w bardzo ubogim środowisku, utworzenie się biofilmu z udziałem tego drobnoustroju np. na powierzchni zbiorników i rur, generuje bardzo duże problemy związane z jego usunięciem ze środowiska produkcji, jak i z utrzymaniem poprawnej jakości mikrobiologicznej samego produktu. Przy ocenie ryzyka powstawania biofilmu należy dobrze sprawdzić nie tylko podatność podłoża na zasiedlanie przez takie bakterie jak B. cepacia, czemu sprzyja chropowata powierzchnia, trudny dostęp podczas mycia, ale również możliwość powstawania tzw. przestrzeni martwych czyli zakończeń czy wypustek rurociągów, gdzie przepływ jest okresowo zahamowany lub zmniejszony. Najlepszą metodą walki z biofilmem jest stałe monitorowanie czystości przestrzeni produkcyjnej mającej bezpośredni, ale i pośredni kontakt z produktem, szybkie usuwanie zanieczyszczeń po procesie produkcyjnym, dokładne mycie i jeśli to możliwe osuszanie powierzchni.

Izolacja i identyfikacja Bcc ze środowiska i z produktów kosmetycznych nastręcza pewne trudności. Burkholderia cepacia należy do mikroorganizmów wolnorosnących i może być łatwo pominięta w rutynowej diagnostyce. Na konwencjonalnych pożywkach mikrobiologicznych, takich jak Macconkey Agar, kolonie B. cepacia complex mogą być zamaskowane przez szybciej rosnące drobnoustroje np. Pseudomonas aeruginosa lub inne pałeczki jelitowe. Na pożywkach nieselektywnych, takich jak Columbia agar czy TSA, bakteria ta rośnie w postaci gładkich, niewielkich kolonii. Optymalna temperatura wzrostu to 28-30°C, choć dobry wzrost obserwuje się także w 37°C, a nawet 40°C [4].

W diagnostyce mikrobiologicznej B. cepacia często stosuje się pożywki agarowe selektywno – różnicujące zawierające substancje przyspieszające wzrost, takie jak specjalne peptony, pirogronian sodu oraz hamujące wzrost mikroflory towarzyszącej: fiolet krystaliczny, sole żółci oraz antybiotyki np. Polimyksynę B, Tikarcylinę (hamują blisko spokrewnione Pseudomonas sp.) i Gentamycynę (hamuje Proteus sp.). Inkubacja zachodzi w 37°C przez 48-72 godziny. Bcc wyrastają w postaci charakterystycznych szaro-zielonych kolonii. Ponieważ kolonie Bcc mogą czasem nie wykazywać cech charakterystycznych, do etapu potwierdzeń pobiera się ich wszystkie rodzaje. W badaniach potwierdzających można wykorzystywać dostępne na rynku komercyjne panele biochemiczne np. do gram-ujemnych pałeczek niefermentujących. Należy tylko pamiętać, że taką metodą możemy nie zidentyfikować dokładnie gatunku B. cepacia , lecz tylko B.cepacia complex lub rodzaj Burkholderia sp. Tak wykonane badanie zajmuje średnio 5-6 dni [22].

Ze względu na trudności z izolacją Bcc, szczególnie zestresowanych komórek, zalecane jest stosowanie etapu namnażania przed hodowlą na pożywkach selektywno-różnicujących [2]. Przyszłość szybkiej i dokładnej diagnostyki B. cepacia to niewątpliwie techniki molekularne, takie jak Ready to Go PCR. Obiecujące wyniki – 100% zgodności w stosunku do metody hodowlanej – uzyskano w badaniach prowadzonych przez zespól z Block Drug Co, w USA [10]. Kontaminowane próbki kosmetyków poddawane były inkubacji przez 24 godziny w TSB z dodatkiem Tween 20 oraz lecytyny sojowej. Następnie przeprowadzano ekstrakcję enzymatyczną DNA i reakcję PCR z zastosowaniem primerów specyficznych dla B. cepacia, odpowiadających fragmentowi 16S rRNA. Cały proces wykrywania i identyfikacji zajął 27 godzin. Biorąc pod uwagę szybki rozwój tego rodzaju metod w diagnostyce klinicznej jak i środowiskowej, należy w najbliższym czasie spodziewać się wejścia testów molekularnych również do rutynowych badań kosmetyków.

Powyższy przegląd informacji na temat Burkholderia sp. dowodzi jej ważną rolę w kontroli bezpieczeństwa mikrobiologicznego produktów kosmetycznych, jak i w nadzorze nad stanem higienicznym środowiska produkcji. Ogólna informacja o obecności mezofilnych bakterii tlenowych w surowcu lub produkcie kosmetycznym powinna być sygnałem do podjęcia głębszych badań co do charakteru tego zanieczyszczenia. Identyfikacja gatunkowa pozwala określić najbardziej prawdopodobne źródło zanieczyszczenia – daje wskazówki, czy przyczyną skażenia jest surowiec, czy może zły stan higieniczny środowiska produkcji. Takie dochodzenie daje nam również możliwość włączenia wyizolowanego z własnego środowiska szczepu do zestawu drobnoustrojów stosowanych do oceny skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej produktu np. na etapie wdrażania produktu – zobacz pkt. 1.2 normy PN-EN ISO – 11930 [20]. Rozszerzenie panelu szczepów testowych o własny lub referencyjny szczep Burholderia cepacia wydaje się bardzo istotne, również ze względu na odporność tego gatunku na niektóre środki konserwujące [23].

Literatura:

1. Alvarez – Lerma F., Maul E., Terradas R. et al. Moisturizing body milk as a reservoir of Burkholderia cepacia: outbreak of nosocomial of nosocomial infection in a multidisciplinary intensive care unit. Available online http://ccforum.com/content/12/1/R10,
2. Barlasov, J.; Sutton, S.; Jakober, R. Recovery of Stressed (Acclimated) Burkholderia cepacia Complex Organisms, American Pharmaceutical Review., 2014.
3. Błaszczyk M.K. Mikrobiologia środowisk. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, 2014.
4. Brenner D.J.; Krieg N.R.; Staley J.T. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition, Vol. 2, 2005, 575-593.
5. Burkcholderia cepacia – materiały informacyjne firmy OXOID.
6. Courtney, J.M.; Dunbar, K.E.; McDowell ,A. et al. Clinical outcome of Burkholderia cepacia complex infection in cystic fibrosis adults. J Cyst Fibros, 2004, 3, 93-98.
7. Heczko, P.B.; Wróblewska, M.; Pietrzyk A. (Red.): Mikrobiologia lekarska. Wyd. PZWL. Warszawa, 2015.
8. https://ec.europa.eu/consumers/consumers_safety/safety_products/rapex/
9. Iwańska, A.; Nowak, J.; Skorupa, W.; Augustynowicz-Kopeć, E. Mikrobiologiczna analiza drobnoustrojów izolowanych z dróg oddechowych dorosłych chorych na mukowiscydozę leczonych w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc, Postępy Nauk Medycznych, t. XXVIII, 4, 2015
10. JIMENEZ,L.; SMALLS, S. Molecular Detection of Burkholderia cepacia in Toiletry, Cosmetic, and Pharmaceutical Raw Materials and Finished Products. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 83, NO. 4, 2000, 963.
11. Libudzisz, Z.; Kowal, K.; Żakowska, Z. Mikrobiologia techniczna tom 2, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2008
12. Mahenthiralingam, E.; Urban, T.A.; Goldberg, J.B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol., 2005,3,144–56.
13. Martin, M.; Winterfeld, I.; Kramme, E.; Ewert, I.; Sedemund-Adib, B.; Mattner, F. Outbreak of Burkholderia cepacia complex caused by contaminated alcohol-free mouthwash. Anaesthesist 2012, 61, 25–29.
14. Matrician, L.; Ange, G.; Burns, S.; Fanning, W.L.; Kioski, C.; Cage, G.D.; Komatsu, K.K. Outbreak of nosocomial Burkholderia cepacia infection and colonization associated with intrinsically contaminated mouthwash. Infect. Control Hosp. Epidemiol.
2000, 21, 739–741
15. Noa, Z., Tzafrir I.; Shulkin, R.; and Paul Salama, P. Salicylate UV-Filters in Sunscreen Formulations Compromise the Preservative System Efficacy against Pseudomonas Aeruginosa and Burkholderia Cepacia, Cosmetics, 7.3 2020, 1l. Web.
16. Orth, D.S.; Dumatol, C., & Zia, S. (1996) Cosmet. Toilet.111, 59–70,
17. Orŭs P.; Gomez – Perez L.; Leranoz S. et al. Increasing antibiotic resistance in preservative – tolerant bacterial strains isolated from cosmetic products. Int. Microbiol., 2015,18,51–59.
18. Palmieri, M.J.; Carito, S.L., & Meyer, R.F. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54, 2838–2841
19. PN – EN ISO 22716:2009; Kosmetyki – Dobre Praktyki Produkcji (GMP) – Przewodnik Dobrych Praktyk produkcji.
20. PN-EN ISO – 11930. Kosmetyki – Mikrobiologia – Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych.
21. Reimer, L.C.; Sarda Carbasse, J.; Soehngen, C.; Podstawka, A.; Gleim, D. and Overmann, J. "Burkholderia Cepacia." (2018). Web.
22. The OXOID Manual, 9th Edition, 2006, 2-86
23. Torbeck, L.; Raccasi, D.; Guilfoyle Burkholderia cepacia: This Decision is Overdue. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 2011, 65 535-543.
24. Zabielska, J.; Kunicka-Styczyńska,A.; Rajkowska, K.; Tyfa, A. Opportunistic Gram-negative rods’ capability of creating biofilm structures on polivynyl chloride and styrene-acronitrile copolymer surfaces, Acta Biochimica Polonica 62.4,2015, 733-737. Web.
25. Zaremba, M. L.; Borowski, J.; Mikrobiologia lekarska. Wydawnictwo PZWL, wydanie III, 220-221.
26. Zlosnik J.E.; Costa P.S.; Brant R. et al. Mucoid and nonmucoid Burkholderia cepacia complex bacteria in cystic fibrosis infections. Am J Respir Crit Care Med, 2011,183, 67-72.

Dorota Merlak[1], Piotr Nowaczyk[1, 2]
[1]Dr Nowaczyk Centrum Badań i Innowacji Sp. z o.o. Sp. K.
[2]Wydział Nauk o Zdrowiu, Uniwersytet Opolski

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Kosmetycznego" 1/2021