Wykorzystanie metod in vitro w badaniu kosmetyków – alternatywa wobec badań na zwierzętach

Ocena bezpieczeństwa chemicznego tradycyjnie opierała się na testach na zwierzętach, ale Unia Europejska od wielu lat promuje zastępowanie, ograniczanie i udoskonalanie testów na zwierzętach. Ponadto we Wspólnocie z dniem 11 września 2004 r. zakazano testowania gotowych produktów kosmetycznych na zwierzętach, a 11 marca 2009 r. poszerzono zakaz o testowanie składników kosmetycznych oraz zakaz wprowadzania do obrotu produktów kosmetycznych i ich składników, które były testowane na zwierzętach (dyrektywa 76/768/EWG3) [1]. Badania na zwierzętach nadal są jednak koniecznym elementem dopuszczenia do obrotu wielu leków oraz produktów chemicznych.

Do europejskiego prawa regulującego eksperymenty na zwierzętach wcielono etyczną zasadę 3R (ang. Replacement, Reduction, Refi nement), pierwotnie sformułowaną jeszcze pod koniec lat 50. XX w. przez Rexa L. Burcha i Williama Russella. Została ona ogłoszona w „Th e principles of humane experimental technique” [2]. Zgodnie z tą zasadą dąży się do zmniejszenia liczby wykorzystywanych zwierząt i przede wszystkim do zastąpienia ich przez modele in vitro, ex vivo i in silico, a także do doskonalenia metod alternatywnych. Dnia 24 listopada 1986 r. Rada Wspólnot Europejskich przyjęła dyrektywę 86/609/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych Państw Członkowskich dotyczących ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych. Od tego czasu nastąpił znaczący postęp w pracach nad opracowaniem jednolitej platformy prawnej obowiązującej w krajach Wspólnoty Europejskiej. Kolejna dyrektywa 2010/63 [2] została przyjęta przez wszystkie kraje UE i stopniowo wprowadzana jest w życie zgodnie z ustawodawstwem poszczególnych członków Wspólnoty. W Polsce została przyjęta w postaci ustawy o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych (Dz. U. 2015, z 26 lutego 2015 r. poz. 266) i weszła w życie 27 maja 2015 r. [3].

W myśl przyjętych zobowiązań prawnych nasz kraj podjął się przestrzegania postanowień dyrektywy, a więc także wprowadzania zasady 3R. Innymi przepisami, które wymagają lub zdecydowanie zachęcają do zastąpienia testów na zwierzętach, są rozporządzenie w sprawie produktów kosmetycznych (1223/2009), REACH (2007/2006) oraz klasyfi kacja, oznakowanie i pakowanie (CLP) (1272/2008) [4].

W 2011 r. na mocy dyrektywy 2010/63/EU formalnie utworzono organizację UE zajmującą się naukową walidacją metod alternatywnych do testów na zwierzętach – EURL ECVAM (Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiej ds. alternatyw dla testów na zwierzętach). Metody opracowane przez Jakość i bezpieczeństwo badawcze są przekazywane do EURL ECVAM, którego ocena solidności, niezawodności i zdolności predykcyjnych metod opiera się na niezależnym przeglądzie raportów z badań walidacyjnych. EURL ECVAM ściśle współpracuje z OECD (Koordynatorzy ds. Metod Badawczych) oraz ICATM (Międzynarodowa Współpraca w Zakresie Alternatywnych Metod Badań) [5].

Przepisy unijne gwarantują, że produkty, które mają kontakt z ciałem ludzkim, są bezpieczne dla naszego zdrowia, a ich produkcja uwzględnia dobrostan zwierząt. Jednak w 80% krajów na świecie testowanie kosmetyków na zwierzętach oraz ich sprzedaż wciąż są dozwolone. W maju 2018 r., Parlament Europejski przyjął rezolucję, w której wzywa do wprowadzenia do 2023 r. globalnego zakazu testowania kosmetyków na zwierzętach, a także do sprzedaży składników testowanych na zwierzętach.

EURL ECVAM utworzyło w państwach członkowskich UE sieć wyspecjalizowanych laboratoriów EU-NETVAL, których misją jest zapewnienie wsparcia dla badań walidacyjnych w celu oceny wiarygodności i przydatności metod alternatywnych [6]. W Polsce od 2015 r. do grupy EU-NETVAL dołączyły dwie jednostki: Laboratorium Biologii Komórkowej Selvita S.A. oraz Pracownia Toksykologii Molekularnej w Zakładzie Toksykologii i Kancerogenezy IMP (Instytut Matki Polki).

Do metod rekomendowanych przez EURL ECVAM należą wytyczne OECD, metody badawcze UE oraz ISO. Dodatkowo należy zaznaczyć, że takie organizacje jak PETA i Leaping Bunny (Cruelty Free International) akceptują wytyczne testowe opublikowane przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD).

Do niedawna do oceny potencjału drażniącego substancji oraz czasu potrzebnego do zniwelowania i ustąpienia powstałych uszkodzeń wykorzystywano opracowany w 1944 r. test Draize’a. Polegał on na podaniu testowanej substancji bezpośrednio do oka królika albinosa. Test podrażnienia oczu Draize (wytyczne OECD TG 405) jest jednym z najbardziej krytykowanych i kwestionowanych badań, które są nadal używane w krajach dopuszczających przeprowadzanie testów na zwierzętach.

Metody alternatywne wykorzystują technologie in vitro (hodowle komórkowe, trójwymiarowe zrekonstruowane modele tkanek), ex vivo (wyizolowane zwierzęce tkanki lub organy) oraz in silico (symulacje komputerowe, modele matematyczne). Wśród badań alternatywnych możemy wyróżnić testy sprawdzające działanie drażniące lub żrące skórę lub oczy, uczulające na skórę, cytotoksyczne, fototoksyczne, genotoksyczne czy mutagenne. Powszechnie uznaje się, że pojedyncza metoda badania in vitro nie jest w stanie zastąpić oceny kryteriów urazu i zapalenia, o których mowa w przepisach przyjętych w metodach badawczych in vivo na zwierzętach, dlatego zaleca się korzystać ze strategii badawczych, które łączą mocne strony poszczególnych metod badań in vitro [7]. W szczególności zalecane są dwa podejścia do testowania:

1. A Top-Down approach – podejście odgórne, zaczynające się od metod badawczych in vitro, które mogą identyfi kować chemikalia powodujące poważne i/lub nieodwracalne uszkodzenia oczu lub skóry;

2. A Bottom-Up approach – podejście oddolne, zaczynające się od metod badawczych in vitro, które mogą identyfikować chemikalia niewymagające klasyfi kacji ze względu na zagrożenie dla oczu lub skóry [8, 9].

Oznaczanie stopnia podrażnienia oka z zastosowaniem linii komórkowych

W badaniach potencjału drażniącego produktów kosmetycznych istotną rolę pełni rogówka. Do oznaczania stopnia podrażnienia oka w wyniku działania produktów kosmetycznych zastosowanie mają m.in. linie komórkowe. Linia komórkowa SIRC (komórki rogówki królika) służy za model badawczy w Teście Uwalniania Czerwieni Obojętnej [10]. Jest to metoda oparta na ocenie cytotoksyczności badanego materiału poprzez oznaczenie wartości stężenia badanego czynnika hamującego żywotność komórki – IC50 (stężenie, przy którym proliferacja komórek zostaje zahamowana w 50%, w odniesieniu do układu kontrolnego) oraz procentu śmiertelności komórek przy stężeniu 50% – PM. Badany produkt rozcieńczany jest w zakresie stężeń od 5% do 50% i stosowany bezpośrednio na komórki. Czerwień obojętna jest markerem żywotności komórek, gromadzącym się w przedziale lizosomalnym nienaruszonej komórki. Gdy następuje uszkodzenie lizosomów lub błony dochodzi do utraty barwnika. Cytotoksyczność substancji badanej jest zatem mierzona jako stopień odbarwienia komórek. Następnie w zależności od wartości IC50/PM produkt klasyfi kowany jest do jednej z czterech grup określających stopień cytotoksyczności.

Innym testem wykorzystującym linię komórkową SIRC jest protokół OECD TG 491, tzw. STE test (ang. Short Time Exposure In Vitro Test Method) [10]. Pozwala on klasyfikować substancje zakwalifi kowane jako kategoria 1 GHS ONZ lub brak kategorii GHS ONZ. Po krótkim, 5-minutowym kontakcie badanego materiału bezpośrednio z komórkami rogówki oceniana jest ich żywotność. W tym celu wykonuje się kolorymetryczny test oparty na zdolności komórek aktywnych metabolicznie do przekształcenia żółtej soli tetrazoliowej (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,- 5-difenylotetrazoliowy, MTT) do fi oletowych kryształów formazanu [11].

Do oznaczania podrażnienia oka może służyć także linia komórkowa L929 (mysie fi broblasty). Z jej użyciem przeprowadza się test agarozowy [12]. Metoda oparta jest na ocenie cytotoksyczności badanego materiału poprzez pomiar średnicy zlizowanych komórek po 24 godz. od aplikacji badanego materiału na monowarstwę komórek pokrytych żelem agarozowym. Ekspozycja komórek następuje po dyfuzji substancji przez warstwę agarozową. Liza komórek wskazuje na cytotoksyczność materiału.

Badania cytotoksyczności in vitro umożliwiają również biologiczną ocenę wyrobów medycznych. Norma PN-EN ISO 10993-5:2009 opisuje wykorzystanie linii komórkowej L929 w badaniu materiałów, urządzeń, komponentów lub ekstraktów z wyrobów medycznych (przygotowanych zgodnie z normą ISO 10993-12). Komórki są bezpośrednio traktowane czterema różnymi stężeniami materiału badanego przez 24 godz., a następnie oceniana jest ich żywotność.

Testowanie kosmetyków na rekonstruowanych modelach 3D skóry i oka

Liczne ograniczenia towarzyszące badaniom in vivo poświęconym działaniu kosmetyków na ludzki naskórek sprawiły, że naukowcy coraz chętniej skupiali swoją uwagę na przeprowadzaniu badań in vitro wykorzystujących pobrane fragmenty skóry ludzkiej lub zwierzęcej. Jednak podczas tego typu testów napotykano ścisłe regulacje i ograniczenia zarówno natury prawnej, jak i etycznej, m.in. z tego powodu OECD dopuściło do badań dotyczących analizy kosmetyków modele rekonstruowanego ludzkiego naskórka lub nabłonka (modele 3D).

W ciągu minionych 40 lat dziedzina ta była intensywnie pogłębiana, a modele naskórka stały się ogólnodostępnym, komercyjnym towarem. Jedną z niewątpliwych zalet korzystania z rekonstruowanych modeli ludzkiego naskórka i nabłonków jest ograniczenie liczby ochotników niezbędnych do badań in vivo, a także są niekwestionowaną alternatywą do testowania kosmetyków na zwierzętach [13].

Ocena podrażnienia skóry

Analiza kosmetyków za pomocą badań wykonywanych na rekonstruowanym ludzkim modelu skóry pozwala m.in. na dostarczenie informacji na temat cytotoksyczności substancji lub mieszanin substancji. Cytotoksyczność to działanie drażniące skórę, które powoduje odwracalne uszkodzenia skóry, a do jej oceny in vitro służą wytyczne zawarte w dokumencie OECD TG 439. Wykorzystywany w tym badaniu zrekonstruowany, trójwymiarowy model ludzkiego naskórka (ang. Reconstructed Human Epidermis, RHE) zbudowany jest z nieprzekształconych keratynocytów pochodzących od człowieka. Po pobraniu komórek od zdrowego dawcy należy hodować je na filtrze lub membranie na granicy faz powietrze – ciecz, aby utworzyć wielowarstwowy, zróżnicowany model naśladujący biochemiczne i fizjologiczne właściwości naskórka. W warunkach in vivo na ludzkiej skórze podrażnienie skóry objawia się głównie rumieniem i obrzękiem spowodowanym zwiększoną przepuszczalnością komórek śródbłonka. Zrekonstruowany model ludzkiego naskórka nie jest unaczyniony, co sprawia, że nie można zaobserwować na nim tego typu zmian. Dlatego do oceny uszkodzenia komórek po zaaplikowaniu na powierzchnię nabłonka badanej substancji chemicznej wykorzystuje się pomiar żywotności komórek. Protokół metody OECD TG 439 zakłada, że po aplikacji, a następnie po upłynięciu odpowiedniego czasu kontaktu, wymyciu produktu kosmetycznego modele nabłonka mają czas, by zwalczyć ewentualne szkody uczynione przez substancję, co pozwala nam na zaobserwowanie długotrwałego efektu, jaki kosmetyk wywiera na skórę. Żywotność komórek w modelu RHE mierzona jest poprzez enzymatyczną konwersję barwnika MTT. Zgodnie z wytycznymi zawartymi w OECD TG 439 metoda ta nadaje się do badania substancji stałych, półstałych, cieczy i wosków, co oznacza, że na zrekonstruowanym nabłonku ludzkiego naskórka można zbadać każdy rodzaj kosmetyku poza gazami i aerozolami. Według klasyfikacji GHS ONZ za pomocą tej metody in vitro można zidentyfikować substancje i mieszaniny drażniące (kategoria 2 GHS ONZ), a w krajach, które nie uznają kategorii 3 GHS ONZ (łagodne substancje drażniące), możliwa jest również identyfikacja niesklasyfikowanych chemikaliów [14].

Innym modelem wykorzystywanym do analizy kosmetyków jest zrekonstruowany nabłonek rogówki ludzkiego oka (ang. Reconstructed Human Cornea-like epithelium, RHC). Substancje chemiczne po kontakcie z tkanką oka mogą spowodować podrażnienie lub uszkodzenia komórek, a nawet pogorszenie widzenia. Podrażnienie oka jest zjawiskiem, które jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni od kontaktu z substancją, w przeciwnym wypadku działanie takie klasyfikuje się jako poważne uszkodzenie. Wytyczne zebrane w dokumencie OECD TG 492 pozwalają na dokonanie oceny podrażnienia oka na skutek działania substancji chemicznej. Zrekonstruowany ludzki nabłonek rogówki naśladuje właściwości histologiczne, morfologiczne, biochemiczne i fi zjologiczne ludzkiego nabłonka rogówki. W badaniach in vivo podrażnienie oka objawia się zmętnieniem rogówki, zapaleniem tęczówki czy zaczerwienieniem spojówki, natomiast w przypadku badań wykonywanych na modelu oka, podobnie jak w przypadku modelu skóry, wykorzystuje się pomiar żywotności komórek po kontakcie z materiałem badanym. Protokół stworzony na podstawie OECD TG 492 pozwala na identyfi kację substancji powodujących poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 GHS ONZ), substancji powodujących podrażnienie oczu (kategoria 2 GHS ONZ), a niewykazujące takiego działania oznacza się jako brak kategorii GHS ONZ [15].

Od 2021 r. korzystając z modelu RHE, możliwe jest również badanie podrażnienia wywołanego działaniem wyrobów medycznych, materiałów lub ich ekstraktów zgodnie ze standardem ISO 10993-23:2021 stworzonym w oparciu o OECD TG 439. Udowodniono, że metoda ta jest równie czuła do wykrywania drażniącego działania związków o niskich stężeniach co testy in vivo – test płatkowy na ludziach oraz test śródskórny na królikach, co czyni ją niezwykle atrakcyjną jako metodę alternatywną [16].

W oparciu o wiedzę zawartą w wytycznych OECD powstał szereg protokołów pozwalających na dokonanie oceny podrażnienia wielu rodzajów tkanek. W ofercie komercyjnej można znaleźć rekonstruowane nabłonki ludzkiej pochwy, dziąseł, jamy ustnej, a także ludzkiego naskórka o widocznej pigmentacji. Badania wykonywane na tego typu nabłonkach również opierają się na pomiarze żywotności skrawków nabłonków po ich kontakcie z badaną substancją. Duży wybór rekonstruowanych modeli nabłonka i naskórka pozwala na zbadanie całego spektrum produktów kosmetycznych, a w zależności od ich przeznaczenia możliwe jest wybranie najbardziej dopasowanego modelu [17].

Ocena korozji skóry (działanie żrące na skórę)

Korozja skóry, czyli działanie żrące, oznacza powstanie nieodwracalnych uszkodzeń skóry, które objawiają się widoczną martwicą naskórka i dalej skóry właściwej na skutek kontaktu z badaną substancją. Wytyczna OECD TG 431 pozwala na ocenę potencjału żrącego produktów kosmetycznych. Do badania, podobnie jak w przypadku OECD TG 439, wykorzystuje się zrekonstruowany ludzki naskórek (RHE) zbudowany z keratynocytów naskórka pochodzenia ludzkiego, a zastosowanie innego protokołu pozwala ocenić tym razem nie podrażnienie skóry, a działanie żrące. Zgodnie z klasyfikacją GHS ONZ w tej metodzie możliwa jest identyfikacja substancji niekorozyjnych i żrących. Wytyczne OECD TG 431 opierają się na założeniu, że żrące substancje chemiczne mają zdolność przenikania warstwy rogowej naskórka poprzez dyfuzję lub erozję i wykazują działanie cytotoksyczne wobec komórek niższych warstw skóry.

Zasada tej metody, tak jak w przypadku pozostałych modeli 3D, polega na kontakcie produktu kosmetycznego ze skrawkami zrekonstruowanego ludzkiego naskórka i następnie pomiarze ich żywotności [18].

Ocena działania fototoksycznego na skórę

Rekonstruowany model ludzkiego naskórka wykorzystywany jest również do badania potencjału fototoksycznego (fotopodrażnienia). Fototoksyczność to ostra reakcja toksyczna pojawiająca się po kontakcie fotoreaktywnej substancji z naskórkiem, a następnie jego ekspozycji na światło. Zasadę oraz przebieg tej metody określają wytyczne OECD TG 498 wydane w czerwcu 2021 r., a więc będące jedną z najnowszych metod alternatywnych. W tej metodzie potencjał fototoksyczny wyznacza się po kontakcie zrekonstruowanego modelu naskórka (RHE) z produktem kosmetycznym w obecności i przy braku symulowanego światła słonecznego, porównując zmniejszenie żywotności komórek w tych dwóch warunkach oświetleniowych. Metoda ta jest niejako połączeniem protokołów metod OECD TG 439 (ocena podrażnienia skóry przy wykorzystaniu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka), OECD TG 432 (standardowe procedury napromieniania) oraz fototoksyczności 3T3 NRU (test in vitro wykonywany na linii komórkowej BALB/c 3T3). Rekonstruowany model ludzkiego naskórka pozwala na wychwycenie zarówno fotopodrażnienia, jak i fotoochronnego działania produktów przeciwsłonecznych. W przeciwieństwie do 3T3 NRU w OECD TG 498 możliwe jest badanie substancji będących emulsjami czy zawiesinami [19, 20].

Metody in vitro w badaniach produktów ochrony przeciwsłonecznej

Również w przypadku oznaczania współczynnika ochrony przeciwsłonecznej (ang. Sun Protection Factor, SPF) podejmowane są starania nad opracowaniem metody in vitro. Klasyczna metoda in vivo według wytycznych normy ISO 24444:2019 wymaga przeprowadzenia badania na skórze zdrowych ochotników, co może wzbudzać pewne obawy natury etycznej.

Opracowywanie alternatywnych metod oznaczania współczynnika SPF trwa od wielu lat, jednak nie jest to łatwe zadanie. Aktualnie trwają prace nad opracowaniem metody in vitro – ISO 23675. Badania są na zaawansowanym etapie i wskazują na obiecującą korelację pomiędzy wynikami in vitro a wartościami SPF in vivo. Metoda ta oparta jest na spektroskopii transmitancji UV, dzięki której pomiar transmisji przez odpowiednie podłoża przezroczyste dla UV umożliwia przewidywanie wartości SPF in vivo. Co ciekawe, metoda ta do aplikacji produktów wymagać będzie specjalnego robota, co ma na celu zestandaryzowanie aplikacji poprzez wyeliminowanie czynnika ludzkiego.

Do tej pory szeroko stosuje się jedynie metodę oznaczania UVA PF (ang. UVA Protection Factor, współczynnik ochrony przed promieniowaniem UVA), np. według wytycznych normy ISO 24443:2012. Produkt nakłada się tu na przezroczyste płytki, które imitują strukturę ludzkiej skóry. Przed i po naświetleniu płytek odpowiednim promieniowaniem wykonywane są pomiary widma transmisji przy użyciu spektrofotometru [21].

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Kosmetycznego" 3/2021