Nowa odsłona w badaniach skuteczności promieniochronnej – nowe techniki badań SPF in vitro

Do niedawna złotym standardem w badaniach skuteczności ochrony przed promieniowaniem słonecznym w Krajach Unii Europejskiej były normy:

• ISO 24444-2019 (Oznaczanie współczynnika ochrony przeciwsłonecznej „in vivo”)
• ISO 24442-2022 (Oznaczanie ochrony przed promieniowaniem UVA „in vivo”)
• ISO-24443-2021 (Oznaczanie ochrony przed promieniowaniem UVA „in vitro”)

Norma ISO 24444 mierzy się z ciągłą krytyką głównie ze względu na kwestię etyczne wykorzystywania ludzi do oceny stopnia uszkodzenia (rumienia), jakiemu ulega skóra po wystawieniu na działanie promieniowania słonecznego. Istnieje również różnica między rzeczywistym promieniowaniem słonecznym a tym stosowanym w normie ISO 24444, ponieważ brakuje w niej długości fal powyżej 400 nm i emituje więcej promieniowania UVB i mniej UVA niż to konieczne. Ponadto  wykazano słabą powtarzalność metody, w testach międzylaboratoryjnych, szczególnie w przypadku wysokich współczynników ochrony. Normy ISO 24442 („in vivo”) i 24443 („in vitro”) stosowane do oceny promieniowania UVA. Obecnie norma 24443 jest częściej stosowana. Próbka jest rozprowadzana cienką warstwą na znormalizowanej płytce PMMA, która  z założenia ma odtwarzać powierzchnię skóry. Jednorodność i powtarzalność warstwy nałożonego preparatu są fundamentalne dla prawidłowego pomiaru. Mierzy się transmitancję „in vitro”, a następnie próbkę poddaje się działaniu znormalizowanej dawki promieniowania UVA. Etap napromieniowania jest konieczny, ponieważ filtry stosowane obecnie do uzyskania szerokiego spektrum ochrony nie są całkowicie fotostabilne. Na koniec ponownie mierzy się transmitancję napromieniowanej próbki.

Jednak uzyskana w ten sposób ochrona (SPF) nie koreluje dobrze z ochroną uzyskaną metodą „in vivo”. Z tego powodu norma przewiduje zastosowanie parametru korekcyjnego, który jest dokładnie oparty na SPF uzyskanym dla tej samej próbki zgodnie z normą ISO 24444. Co paradoksalnie oznacza, że do uzyskania wyniku „in vitro” konieczny jest wynik z badania „in vivo”.  Z tego powodu Wspólnota Europejska zaleciła znalezienie alternatywnych metod analitycznych do oceny ochrony przeciwsłonecznej produktów kosmetycznych, które byłyby dokładniejsze i bardziej powtarzalne niż te obecnie stosowane. Powstała grupa zadaniowa koordynowana przez Komitet Techniczny ds. Kosmetyków ISO/TC 217, w której uczestniczyli główni producenci kremów przeciwsłonecznych i różne instytucje akademickie w celu opracowania alternatywnych metod badawczych.  Zaproponowano kilka alternatywnych metod, które następnie zbadano w różnym stopniu. Pięć z nich poddano charakterystyce statystycznej w porównaniu z metodą złotego standardu ISO24444:2019 w wielostronnym konsorcjum technicznym (ALT-SPF). Dwie z tych metod posiadają obszerne dane z badań laboratoryjnych dotyczących dużej liczby produktów ochrony przeciwsłonecznej, oceniające ich korelację z ISO24444:2019. Obie metody przeszły pełny, formalny proces standaryzacji w ramach ISO/TC2172 i są obecnie publikowane jako pełne, międzynarodowe normy ISO:

• In Vitro ‘Double Plate’ Method (ISO 23675:2024) 
• Hybrid Diffuse Reflectance Spectroscopy or ‘HDRS’ (ISO 23698:2024)

W czerwcu 2025 roku Cosmetic Europe wydało rekomendacje w zakresie stosowania metod alternatywnych w badaniach skuteczności ochrony przeciwsłonecznej „COSMETICS EUROPE RECOMMENDATION N° 26 Cosmetics Europe Recommendation On the Use of Alternative Methods to ISO24444:2019 Revised June 2025” . Dokument ten stanowi istotny punkt zmiany w obszarze badań skuteczności produktów ochrony przeciwsłonecznej. W chwili obecnej rekomendowane są metody alternatywne do oceny skuteczności ochrony przeciwsłonecznej, nie oznacza to jednak że dostępne obecnie na rynku, ocenione metodą in vivo (ISO 24444:2019, jedyna dostępna do niedawna norma) produkty, pozostają aktualne i zgodne z wymogami regulacyjnymi. Jednak w przyszłości, w przypadku nowych produktów wartości SPF będą określane preferencyjnie przy użyciu jednej z dwóch nowych alternatywnych metod.

Biorąc pod uwagę, że prawidłowe stosowanie dwóch nowych metod wymaga odpowiedniego przeszkolenia i doświadczenia, zdecydowanie zaleca się stopniowe wdrażanie tych nowych metod badań SPF jako preferowanych alternatyw dla normy ISO 24444:2019:

ISO 23675: 2024 – FPS „in vitro” (metoda dwupłytkowa) – różnice w stosunku do ISO 24444

• brak udziału ochotników, wykorzystano spektrofotometrię „in vitro”.
  • stosowane są dwa rodzaje płytek PMMA: piaskowane i formowane. Należy użyć co najmniej trzech płytek piaskowanych i trzech formowanych. Przed użyciem należy je termostatować przez 12 godzin w temperaturze 27°C.
  • zaleca się stosowanie automatycznego robota do rozprowadzania kremu przeciwsłonecznego na przezroczystym podłożu, aby zapewnić jednorodność i powtarzalność uzyskanej warstwy (podstawowy krok).
  • stosuje się to samo źródło promieniowania, co w normie ISO 24444.
  • spektrofotometr używany do pomiaru transmitancji musi umożliwiać poziome ustawienie płytek z rozprowadzonym kremem przeciwsłonecznym, aby ograniczyć migrację produktu.
  • spektrofotometr musi umożliwiać wykonanie do dziewięciu pomiarów na każdej płytce (16 cm²) w czasie krótszym niż dwie minuty.
  • symulator słoneczny (łuk ksenonowy z odpowiednimi filtrami) musi utrzymywać temperaturę na poziomie (27 ± 2)°C i nie generować prądów powietrza nad płytkami, aby uniknąć przerwania utworzonej powłoki.
  • Podobnie jak w wersji normy ISO 24443 z 2021 r., wymagane są trzy różne wzorce odniesienia: P2 (SPF 2-24); P6 (SPF 25-49); i P8 (SPF powyżej 50).
  • Podobnie jak w normie ISO 24443, transmitancję mierzy się najpierw na próbce nienapromieniowanej, a następnie na próbce napromieniowanej.
  • Wymagane parametry spektrofotometru są identyczne z parametrami określonymi w normie ISO 24443.

Rysunek 1 podsumowuje poszczególne etapy realizacji:

Obliczenia przeprowadza się poprzez uśrednienie pomiarów absorbancji trzech piaskowanych i trzech formowanych płytek, wykonanych parami, na które wpływa współczynnik empiryczny zależny od formy kosmetycznej badanego produktu. Czas ekspozycji płyt na źródło promieniowania oblicza się podobnie jak w normie ISO 24443. Ostatecznie, końcowe wartości SPF „in vitro” i UVA-PF „in vitro” oblicza się poprzez całkowanie poszczególnych wartości absorbancji uzyskanych dla każdej długości fali z napromieniowaniem i bez niego, a następnie uśrednianie ich na podstawie widma działania rumienia (w pierwszym przypadku) i widma działania PPD (w drugim). Wartości tego drugiego są szczegółowo opisane w normie w krokach co 1 nm, dlatego używany spektrofotometr musi rozróżniać długości fal z tą samą precyzją. Procedura, a przede wszystkim obliczenia, są bardzo złożone i uciążliwe. Konieczne są programy obliczeniowe, które zbierają dane i wykonują obliczenia automatycznie. Podsumowując, konieczne jest posiadanie źródła promieniowania z wbudowanym chłodzeniem płyt PMMA i możliwością naświetlania płytek umieszczonych poziomo, robota do rozprowadzania próbek spełniającego wymagania normy oraz spektrofotometru, który umożliwia również skanowanie i szybki pomiar próbek za pomocą zintegrowanego programu obliczeniowego.

ISO 23698:2024 – Measurement of Sunscreens Efficacy by Diffuse Reflectance Spectroscopy (DRS)

Poprzednia metoda dwupłytowa stanowi udoskonalenie wcześniejszych metod, mając na celu wyeliminowanie wszystkich źródeł zmienności, jakie występowały (takich jak różnice w typie skóry, różnice w nakładaniu warstwy produktu na skórę ludzką, jak i na płytki PMMA, spływanie i/lub niszczenie warstwy przez ogrzewanie itp.). Natomiast zastosowanie odbicia rozproszonego do oceny zdolności ochronnej kosmetyku przed promieniowaniem słonecznym wykorzystuje całkowicie nową technikę i koncepcję, eliminując wcześniej wymienione zastrzeżenia etyczne, głównie dotyczące normy ISO 24444.

• Żadne sztuczne urządzenie nie jest w stanie w pełni odtworzyć ludzkiej skóry.
  • Odbicie rozproszone zapewnia unikalne podejście do pomiaru absorbancji „in vivo” przy bardzo niskich dawkach promieniowania UV, które nie powodują uszkodzeń komórek.
  • Łącząc charakterystykę absorbancji UVA ochronnika, mierzoną metodą DRS, z pełną krzywą absorbancji zmierzoną „in vitro” i stosując proces „hybrydyzacji” obu pomiarów, można oszacować SPF, który wykazał dobrą korelację z pomiarami wykonanymi „in vivo” zgodnie z normą ISO 24444.
  • Technika ta nosi nazwę „hybrydowej spektroskopii odbicia rozproszonego” (HDRS).
  • Poprzez ekspozycję próbki na promieniowanie „in vitro” można przewidzieć UVA-PF.
  • Istnieją urządzenia do wykonywania DRS zarówno monochromatycznie, jak i polichromatycznie. Zastosowana technika analityczna różni się w zależności od dostępnego sprzętu.

Ograniczeniem tej metody jest to, że skóra odbija bardzo mało promieniowania o długościach fal poniżej 320 nm, ponieważ melanina, DNA i białka absorbują promieniowanie UVB. Dlatego pomiar „in vivo” można wykonać tylko w zakresie od 320 do 400 nm. Rozwiązaniem polegającym na „dołączeniu” do krzywej uzyskanej „in vivo” brakującej części widma z pomiaru „in vitro” jest „dołączenie” do niej brakującej części widma z pomiaru „in vitro”. Pomiar „in vitro” w zakresie od 290 do 320 nm przeprowadza się zgodnie z techniką ISO 24443.

Obliczenia są uciążliwe, ponieważ muszą być wykonywane w odstępach 1 nm, zarówno dla widma działania rumienia (w UVB), widma PPD (w UVA), jak i widmowego natężenia promieniowania przez odbicie rozproszone (UV-SSR). Wykonanie tych obliczeń ręcznie jest praktycznie niemożliwe, dlatego nieliczne dostępne na rynku urządzenia nadające się do wykorzystania tej techniki posiadają zintegrowaną, oprócz podwójnego światłowodu, możliwość zaprogramowania obliczeń do automatycznego wykonywania.

Różnice w wynikach badań

Zgodnie z wytycznymi Cosmetics Europe „COSMETICS EUROPE RECOMMENDATION N° 26 Cosmetics Europe Recommendation On the Use of Alternative Methods to ISO24444:2019 Revised June 2025” w przypadku konieczności ponownego przetestowania produktów dostępnych na rynku przez zewnętrzne podmioty  i uzyskania różnych wyników. Wraz z publikacją alternatywnych metod testowania SPF istnieje możliwość, że produkty dostępne na rynku pierwotnie testowane metodą in vivo mogą z czasem zostać ponownie przetestowane przez podmiot zewnętrzny z użyciem innej metody. W przypadku ponownego testowania produktu przez podmioty zewnętrzne, prowadzącego do rozbieżności w wynikach w porównaniu z pierwotnym testem, Cosmetics Europe zaleca następujące podejście:

Produkt, pierwotnie testowany za pomocą zwalidowanej metody badawczej A w celu potwierdzenia deklarowanego współczynnika SPF, jest ponownie testowany przez osobę trzecią za pomocą zwalidowanej metody badawczej B w laboratorium X…

– Scenariusz 1: Wynik testu nie wykazuje znaczącej rozbieżności z deklarowanym współczynnikiem SPF: Dalsze testowanie nie jest konieczne.

– Scenariusz 2: Wynik testu metodą B jest znacznie niższy niż deklarowany współczynnik SPF. W takim przypadku ostateczny wniosek należy wyciągnąć dopiero po ponownym przetestowaniu produktu metodą A w innym laboratorium badawczym niż laboratorium X i z uwzględnieniem danych firmy potwierdzających deklarowany współczynnik SPF na opakowaniu. Jeśli wynik ponownego testowania nie wykazuje znaczącej rozbieżności z deklarowanym współczynnikiem SPF: Dalsze działanie nie jest konieczne.

W przypadku pomiaru UVAPF nową, alternatywną metodą zamiast ISO 24443:2021 lub ISO 24442:2022, należy postępować zgodnie z podobnym uzasadnieniem, jak opisane powyżej.

Wnioski

Po kilkudziesięciu latach, w których metody określania współczynnika SPF i UVA-PF w celu oceny ochrony zapewnianej przez filtry przeciwsłoneczne przed promieniowaniem UV pozostawały niezmienione pod względem koncepcyjnym, z wyjątkiem udoskonaleń w stosowanych technikach mających na celu zmniejszenie rozbieżności międzylaboratoryjnych oraz różnic między wynikami uzyskanymi „in vivo” i „in vitro”, osiągnięto międzynarodowy konsensus w sprawie przyjęcia dwóch nowych metod. Metody te mają na celu przezwyciężenie krytyki etycznej i wdrożeniowej, jaką pojawiły się w przypadku norm ISO 24444 i ISO 24443.. Zarówno ISO 23675 (oznaczanie współczynnika SPF i UVA-PF „in vitro”), jak i ISO 23698 (oznaczanie współczynnika SPF i UVA-PF metodą rozproszonego odbicia) wymagają znacznych początkowych inwestycji w nowoczesny sprzęt i intensywnego szkolenia personelu, który będzie go obsługiwał.