Przyszłość bez testów na zwierzętach

NAM – New Approach Methodologies – jest pojęciem zbiorczym dla szerokiej grupy metod in silico, in vitro, ex vivo  i in chemico (Tabela 2). Oznaczają one alternatywne, uzupełniające lub udoskonalające metody do metody na zwierzętach, przeprowadzane w celu przewidywania niebezpiecznych właściwości substancji. Rozwój NAM i ich wykorzystanie do oceny ryzyka odbywa się zgodnie z zasadami 3R (zastępowanie, ograniczanie i udoskonalanie) dla standardowych eksperymentów na zwierzętach. W przeciwieństwie do tradycyjnych testów toksykologicznych, które generują wiedzę na temat niekorzystnych skutków szczytowych u zwierząt doświadczalnych, metody NAM dostarczają dowodów na to, dlaczego niekorzystny skutek jest prawdopodobny.

Tabela 2. Przykłady metod NAM.

Wyniki metod NAM razem z opisem ekspozycji, są danymi wejściowymi do przeprowadzenia NGRA – Next  Generation Risk Assessment.

NGRA ma na celu wdrożenie metod NAM do oceny ryzyka i poleganie na nowych testach in vivo na zwierzętach tylko w ostateczności. NGRA opiera się na trzech poziomach, które pokazano w Tabeli 3.

Tabela 3. Poziomy oceny ryzyka według NGRA.

Metody alternatywne mogą fundamentalnie zmienić dzisiejsze podejście regulacyjne, aby umożliwić podejmowanie istotnych decyzji z punktu widzenia człowieka, w oparciu o ocenę zagrożeń i narażenia.

Jeśli nie obserwuje się żadnej bioaktywności przy stężeniach istotnych dla konsumenta, nie może być żadnych negatywnych skutków dla zdrowia. Jeśli obserwuje się bioaktywność przy stężeniach istotnych, wymagane są dalsze badania w celu ustalenia, czy może to skutkować niekorzystnym skutkiem. NGRA w żadnym momencie nie próbuje przewidzieć wyników badań toksykologicznych przy dużych dawkach na zwierzętach.

W tradycyjnej ocenie bezpieczeństwa składników kosmetycznych, wylicza się marginesy bezpieczeństwa. W kontekście NGRA stworzono nowy parametr – BER – bioactivity/exposure ratio, czyli współczynnik bioaktywność-ekspozycja. Ma on wskazywać, czy użycie składnika jest bezpieczne, czy nie.

Gdy BER jest duży, jest mało prawdopodobne, aby wewnętrzne poziomy wywoływały bioaktywność, więc prawdopodobieństwo wystąpienia działań niepożądanych jest niskie. Przeciwnie, gdy BER jest mały, substancja jest potencjalnie niebezpieczna i może być konieczna dodatkowa lub udoskonalona metodologia. BER muszą zostać zintegrowane z innymi dowodami (istniejącymi danymi, prognozami in silico).

Pierwsza na świecie strategia toksykologiczna bez badań na zwierzętach

W opinii wielu konsumentów, wielkie koncerny nie dbają o dobrostan zwierząt. Tymczasem to często one mają odpowiednie fundusze, by zająć się rozwojem metod alternatywnych. W 2021 roku, dzięki współpracy dwóch dużych firm produkujących surowce, OECD zatwierdziło pierwszą na świecie strategię oceny toksykologicznej bez testów na zwierzętach, która służy do określenia, czy substancja działa uczulająco na skórę – Guideline No. 497: Defined Approaches on Skin Sensitisation. Zgodnie z nią, na podstawie trzech metod alternatywnych, identyfikuje się zagrożenie (czy substancja jest lub nie uczulająca). Strategia ta opiera się na wnioskowaniu na podstawie pozytywnych wyników 2 z 3 przeprowadzonych badań. Jeśli po wykonaniu 2 testów otrzymujemy zgodne wyniki, możliwa jest ocena „substancja uczulająca” / „substancja nieuczulająca”. W przeciwnym razie, należy wykonać trzeci test. Jeśli wyniki dwóch z trzech przeprowadzonych testów będą konkluzyjne, można dokonać klasyfikacji, jeśli nie – wymagane będą dalsze badania.

Metoda opiera się na ciągu zdarzeń, przedstawionych na Rysunku 1. Każde z metod (DPRA, tzw. KeratinoSens oraz h-CLAT) odnosi się do innego „wydarzenia kluczowego”.

Rysunek 1. Schemat AOP, przedstawiający zastosowanie wydarzeń kluczowych do określania działania uczulającego na skórę zgodnie z metodyką OECD 497. Na podstawie „In Vitro Skin Sensitization the 2 out of 3 Approach”

DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay) – OECD 442C, metoda in chemico, określa, jak w jakim stopniu hapteny wiążą się z białkami – więcej cząsteczek badanej substancji związało się z białkiem, tym silniej jest ona reaktywna.

ARE-Nrf2 Luciferase Assay (KeratinoSens) – OECD 442D, metoda in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych, dotyczy zmiany ekspresji genów w keratynocytach. Zmodyfikowana linia keratynocytów zawiera gen lucyferazy (która ma zdolność do luminescencji), znajdujący się pod kontrolą tego samego promotora, co szlak sygnałowy ARE. Podczas ekspozycji na substancję alergizującą, aktywowane są geny Nrf2 (również związane z ARE). Poziom ekspresji mierzy się poprzez pomiar luminescencji, związanej z aktywowaną tym samym sposobem lucyferazą.

 h-CLAT (Human Cell Line Activation Test) – OECD 442E, metoda in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych, określa zmiany w ekspresji markerów na powierzchni komórek, związanych z aktywacją monocytów i komórek dendrycznych. Polega na pomiarze ekspresji określonych markerów komórkowych. Komórki, które są wyznakowane fluorochromowymi przeciwciałami, zliczane są po określonym czasie inkubacji z daną substancją cytometrią przepływową – liczą się tylko te, do których dołączyły się specyficzne przeciwciała. Aby substancja była uznana za uczulającą, musi być osiągnięty odpowiedni poziom ekspresji.

Strategia OECD 497 zapewnia lepszą przewidywalność ryzyka wystąpienia alergii skórnej u ludzi, niż tradycyjne testy na zwierzętach. Jej czułość to 82% i 89% (odpowiednio dla testu LLNA i na ludziach), a swoistość odpowiednio 85% i 88%. Jest to lepsze dopasowanie, niż wyników LLNA do testów na ludziach. Niestety, dla wielu składników kosmetycznych metoda ta może nie być odpowiednia, ze względu na ograniczenia testów – szczególnie dla substancji lipofilowych lub będących mieszaninami wielu związków chemicznych (np. ekstrakty roślinne). Na Rysunku 2 pokazano przykłady substancji, dla których prawidłowo przewidziano działania uczulające.

Rysunek 2. Przykłady substancji, dla których prawidłowo przewidziano działanie uczulające na skórę zgodnie z metodą 2z3. Opracowanie własne.

Dodatkowo, zmodyfikowana metoda DPRA, w której pomiary przeprowadza się dla kilku różnych stężeń badanej substancji oraz dla kilku punktów czasowych, może służyć kategoryzacji potencjału uczulającego. Na podstawie logarytmów stałej reakcji substancje można przypisać do kategorii Skin Sens. 1A lub 1B/nieuczulająca, zgodnie z systemem klasyfikacji substancji GHS.

Wyzwania dla metod alternatywnych

Największymi problemami związanymi z rozwojem NAM, są: ich zdolność prawidłowej predykcji, powtarzalność, kwantyfikacja oraz brak dostosowania ram prawnych do coraz szerszego ich wykorzystywania. W 2023 roku German Research Foundation wydało oświadczenie, w którym stwierdzono, że ​​metody NAM nie są jeszcze na tyle zaawansowane, aby można było nimi całkowicie zastąpić testy na zwierzętach.

ECHA odrzuciła 75% wyników z badań read-across. Metody NAM są używane raczej w celach przesiewowych, niż do określania konkretnych, toksykologicznych punktów końcowych. Wiele z nich – toksyczność ostra i dawki powtarzalnej, reprotoksyczność, rakotwórczość – nie mają zwalidowanych metod alternatywnych. Wprowadzenie nowej klasy zagrożeń – działania zaburzającego funkcjonowanie układu hormonalnego (ED HH) – również wiązane jest z potencjalnie wzrostem konieczności testowania na zwierzętach. Mimo że istnieje wiele testów in vitro do oceny tych właściwości, są one akceptowane tylko, jeśli wynik jest pozytywny (w podejściu regulatorów, nie są wystarczające do zatwierdzenia, że substancja nie ma działania ED).

Zmiany legislacyjne na horyzoncie

W pierwszym workshopie Komisji Europejskiej (w grudniu 2023 roku, który odbył się w odpowiedzi na opisywaną wcześniej Inicjatywę Obywatelską) w sprawie wyznaczenia planu działania wycofywania się z testów na zwierzętach z oceny bezpieczeństwa chemikaliów wzięło udział ok. 500 delegatów – z agencji rządowych i NGO, przemysłu, naukowców. Jesienią 2024 roku zbierano uwagi pod inicjatywą „Badania na zwierzętach na potrzeby ocen bezpieczeństwa chemicznego – plan działania Komisji na rzecz stopniowego wycofywania takich badań”. Dokument, którego publikację planuje się na koniec 2025 roku lub początek 2026 roku, ma określić kamienie milowe oraz konkretne działania, w tym ustawodawcze, które muszą zostać wdrożone, aby ograniczać i wycofywać się z badań na zwierzętach w ramach wszelkich aktów prawnych związanych z chemikaliami. Przejście na metody alternatywne musi nadal zapewniać wysoki poziom ochrony zdrowia człowieka i środowiska. Plan działania ma określić sposoby rozszerzenia i przyspieszenia opracowywania, walidacji i wdrażania metod badawczych bez udziału zwierząt oraz przedstawić, w jaki sposób do nowego podejścia będzie musiała zostać zmieniona legislacja.

Podsumowanie

Dbanie o dobrostan zwierząt w kontekście badań toksykologicznych, jest nie tylko wymogiem prawnym, wynikającym z wielu regulacji, ale również rzeczą, której domagają się konsumenci. Marki posługują się logo, oświadczeniami negatywnie sformułowanymi (bez okrucieństwa, nietestowane na zwierzętach), aby wzbudzić emocje, które przełożą się później na zakup produktu. Brakuje edukacji i wyjaśnień, co właściwe ma znaczyć określenie „cruelty-free”, również w samym środku branży kosmetycznej. Również cała sfera badań alternatywnych jest w fazie rozwoju, a złożoność tych zagadnień nie jest prosta do przystępnego wytłumaczenia konsumentowi.