Przegląd wybranych metod oceny właściwości przeciwutleniających ekstraktów roślinnych

Czynnikami powodującymi wzrost obecności wolnych rodników są zmiany środowiskowe, niewłaściwy styl życia czy nadmierny stres. Nie sposób jednak uniknąć kontaktu z nimi, gdyż ich źródłem są także podstawowe procesy fizjologiczne, takie jak np. oddychanie komórkowe. Problem pojawia się, kiedy zbyt duża ilość ROS akumulujących się w organizmie prowadzi do zachwiania równowagi pomiędzy reakcjami wolnorodnikowymi i przeciwutleniającymi, prowadząc tym samym do uszkodzeń struktur komórkowych. Zjawisko to nazwane jest stresem oksydacyjnym. Wśród wolnych rodników tlenowych istotne znaczenie ma anionorodnik ponadtlenkowy (O2-) oraz produkty jego konwersji, takie jak nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (OH-) i nadtlenoazotyn (ONOO-)[1,2]. Reaktywne rodniki tlenowe to nic innego jak grupa niestabilnych cząsteczek, które powstają we wszystkich komórkach podczas procesów fizjologicznych i biochemicznych. Nadmierna ich produkcja może powodować uszkodzenia komórek i tkanek poprzez modyfikacje fosfolipidów, białek i kwasu nukleinowego. ROS mają negatywny wpływ przede wszystkim na organelle i błony komórkowe. Ich nadmiar powoduje peroksydację lipidów błonowych i modyfikację białka błonowego. W rezultacie zmienia się struktura membran, przez co zaburzone są ich funkcje. Wolne rodniki tlenowe powodują zmiany w przepuszczalności i płynności błony komórkowej, aktywności enzymów wewnątrzkomórkowych i kanałów jonowych. Rodniki te mogą również powodować uszkodzenia DNA, prowadząc do zmian mutagennych i śmierci komórek. Na szczęście dobrze funkcjonujące komórki mają zdolność obrony przed destrukcyjnym działaniem wolnych rodników przez systemy antyoksydacyjne: enzymatyczny i nieenzymatyczny[3]. Do systemu enzymatycznego zalicza się dysmutazę ponadtlenkową (SOD), katalazę (CAT), peroksydazę glutationu (GSH-Px) oraz reduktazę glutationu (GSSGR). System nieenzymatyczny składa się z grupy substancji zdolnych do neutralizacji ROS, takich jak kwas askorbinowy, glutation czy melatonina. Antyoksydantami są także wtórne metabolity pozyskiwane z roślin, do których zalicza się m.in.: polifenole, flawonoidy, izoflawony, antocyjany, karotenoidy, betalainy[4].

Z tego powodu roślinne surowce od wieków są chętnie pozyskiwane i wykorzystywane przez człowieka nie tylko w produktach leczniczych, ale także w kosmetycznych i pielęgnacyjnych. Obecnie istnieje możliwość dogłębnej analizy jakościowej i ilościowej danego surowca obejmującej m.in. ocenę zawartości substancji aktywnych, a także wszelkich zanieczyszczeń. Warto wspomnieć, że wymagania stawiane przez Farmakopeę Polską i Europejską dotyczące oceny jakości oraz kwalifikacji surowca do obrotu są coraz większe. Oprócz badań nad oceną zawartości substancji czynnych obecnych w surowcu, niezwykle ważne jest wykrycie ewentualnych zanieczyszczeń biologicznych, takich jak fragmenty obcych gatunków roślin, oraz chemicznych, np. związków metali ciężkich czy pestycydów[5,6].

Rynek kosmetyczny coraz częściej skupia swoją uwagę na pozytywnych aspektach wykorzystania roślinnych surowców przeznaczonych do produktów kosmetycznych. Dlatego ważne jest, aby zbadać potencjalny surowiec pod względem właściwości antyoksydacyjnych, które są tak ważne w spowolnieniu przedwczesnego starzenia się komórek, a co za tym idzie pogorszenia kondycji skóry. Surowce roślinne o właściwościach antyoksydacyjnych są niestabilne, dlatego w celu wyeliminowania strat metabolitów wtórnych należy poddać je wcześniej właściwej dla rośliny metodzie ekstrakcji. Odpowiednio przygotowane ekstrakty roślinne poddaje się wielu metodom oceniającym zawartość wtórnych metabolitów roślinnych, jak również zdolność usuwania wolnych rodników wskazujących na właściwość antyoksydacyjną.

Popularną metodą służącą do oceny zdolności usuwania wolnych rodników przez surowce roślinne jest metoda z użyciem roztworu DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl). Rodnik DPPH w roztworze alkoholu ma barwę purpurową z maksimum absorbancji przy długości fali 515 nm. W czasie reakcji przyjmuje elektron przekazany przez substancję przeciwutleniającą, traci swój purpurowy kolor, zmieniając go na żółty w obecności utleniaczy. Zmianę tę określa się ilościowo na podstawie zmian absorbancji[7]. Miarą aktywności antyoksydacyjnej jest wartość parametru EC50 (ang. efficient concentration) lub niekiedy IC50, który określa stężenie antyoksydantu powodujące spadek początkowego stężenia rodnika o 50%. Zawartość przeciwutleniaczy w badanym produkcie można też wyrazić jako ilość równoważników substancji odniesienia (Randox, Trolox lub kwas askorbinowy) na jednostkę masy lub objętości[8]. Procedura jest dosyć prosta w wykonaniu. W trakcie przeprowadzania analizy należy jak najbardziej ograniczyć dopływ tlenu i światła do próbki w celu wyeliminowania spadku absorbancji roztworu DPPH. Zaletą tej metody jest szybkość, dokładność oraz ekonomiczność. Co więcej, roztwór DPPH może reagować z całą próbką, a wystarczający czas podany w metodzie pozwala rodnikowi DPPH na powolną reakcję nawet ze słabymi przeciwutleniaczami[9]. Roztwór DPPH jest rozpuszczalny tylko w rozpuszczalniku organicznym (najczęściej metanolu czy etanolu), jednak metoda ta może być stosowana do badania zarówno hydrofilowych, jak i lipofilowych przeciwutleniaczy. Użycie rodnika roztworu DPPH jest dosyć często stosowane podczas określenia właściwości antyoksydacyjnych związków fenolowych[10].

Kolejną powszechnie stosowaną metodą do oceny właściwości antyoksydacyjnych ekstraktów roślinnych polegającą na ocenie stopnia zmiatania wolnych rodników jest ABTS. Test ten jest uważany za jedną z najbardziej czułych technik identyfikacji aktywności przeciwutleniaczy, gdyż odpowiedź przeciwutleniaczy obejmuje szybszą kinetykę reakcji. Pierwotnie metoda ta opiera się na zdolności przeciwutleniacza do stabilizacji barwnego rodnika kationowego ABTS, który może być wcześniej utworzony przez utlenianie ABTS (2,2’-azobis(- 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian)) przez methemoglobinę i nadtlenek wodoru[11,12]. Zmodyfikowana technika wytwarzania rodnika kationowego ABTS+ obejmuje bezpośrednie wytwarzanie zielono-niebieskiego chromoforu ABTS w reakcji między ABTS i nadsiarczanem potasu. Wytworzone podczas reakcji rodniki mają barwę niebieskozieloną, substancje przeciwutleniające, redukując kationorodnik, powodują zanik barwy roztworu, przy czym spadek intensywności zabarwienia zależy od zawartości antyoksydantów w roztworze. Zmiatanie wolnych rodników ocenia się spektrofotometrycznie, a maksimum absorbancji obserwuję się przy długościach fal: 645, 734, 815 nm. Stopień odbarwienia roztworu pozwala ocenić procentową inhibicję rodnika kationowego ABTS, która jest określana w funkcji stężenia przeciwutleniacza i czasu reakcji. Zwykle wyniki wyraża się jako ilość równoważników Troloksu na jednostkę objętości bądź masy próbki (TEAC)[13]. Jedną z zalet tej metody jest to, że ABTS jest rozpuszczalny zarówno w środowisku wodnym, jak i organicznym, co pozwala na ocenę hydrofilowych i lipofilowych przeciwutleniaczy z dużą precyzją nawet w związkach silnie pigmentowanych. Stosunkowo nieskomplikowana procedura oraz szybki czas reakcji także przemawiają na korzyść popularności stosowania tej metody. Do wad tej techniki należy poprzednia generacja ABTS, która musi być wcześniej wytworzona w wyniku reakcji chemicznej (dwutlenek manganu, nadsiarczan potasu, ABAP), enzymatycznej (peroksydaza, mioglobina) lub elektrochemicznej, oraz to, że kinetyka reakcji z niektórymi przeciwutleniaczami może być powolna, a zatem może prowadzić do błędów w określaniu zdolności antyoksydacyjnej[14].

Metoda oceny zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORAC) mierzy zdolność przeciwutleniającą substancji. Test ten polega na uszkodzeniu sondy fluorescencyjnej (molekularnej) przez wolne rodniki tlenowe (ROS), co prowadzi do utraty intensywności fluorescencji mierzonej w czasie. Powstałe uszkodzenie można skorelować z ilością obecnego utleniacza. Dodatek przeciwutleniacza absorbuje wygenerowane ROS, umożliwiając utrzymanie sygnału fluorescencyjnego[15]. Trolox® (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy) jest analogiem witaminy E i znanym przeciwutleniaczem. Jest używany jako standard, według którego porównuje się wszystkie nieznane przeciwutleniacze. Dlatego wyniki ORAC są powszechnie określane jako odpowiedniki Trolox, obliczane na podstawie krzywej kalibracyjnej[16]. Określenie zdolności przeciwutleniającej wymaga integracji pól powierzchni oznaczanych jako AUC (ang. area under curve) pod krzywymi fluorescencji dla próbki badanej i próby odniesienia[17].

Do oznaczenia aktywności antyoksydacyjnej stosuje się także metodę polegającą na redukcji jonów metali do jonów o niższym stopniu utlenienia przez badany antyoksydant. Do tej kategorii zalicza się metodę FRAP (ang. ferric ion reducing antioxidant parameter) oraz CRA (ang. copper reduction assay). FRAP polega na określeniu zdolności jonów Fe3+ do jonów Fe2+, które kompleksonowane są przez TPTZ (2,4,6-tris(-2-pirydylo)-1,3,5-triazyn) z wytworzeniem intensywnego, niebieskiego zabarwienia o maksimum absorbancji przy długości fali = 593 nm[18]. W celu określenia zdolności absorbancji należy porównać zmianę absorbancji badanej próbki ze zmianą absorbancji próbki wzorcowej Fe2+. Wyznaczona wartość próbki badanej jest wprost proporcjonalna do stężenia antyoksydantu. Jednostka FRAP określa zdolność redukcji 1 mola Fe3+ do Fe2+. Zaletą tej techniki jest szybki przebieg analizy[19]. Dodatkowo metoda jest tania, a otrzymane wyniki są powtarzalne. Ze względu na możliwość analizy substancji o potencjale redoks mniejszym niż 0,7 V (potencjał redoks Fe3+: TPTZ = 0,7 V) doskonale sprawdza się do oznaczania aktywności przeciwutleniającej materiału biologicznego, np. osocza. Oprócz tego FRAP ostatnimi czasy z powodzeniem cieszy się w badaniach nad surowcami roślinnymi[20]. Z kolei metoda CRA polega na redukcji jonów Cu2+ do jonów Cu1+ pod wpływem przeciwutleniaczy. Pomarańczowy kompleks z miedzią tworzy się z wykorzystaniem bathokuproiny (2,9-dimetylo-4,7-difenylo-1,10-fenantrolina), będącym chromoforem w maksimum absorbcji 490 nm. Również można wykorzystać neokuproinę (2,9-dimetylo-1,10-fenantrolina), tworzącą także pomarańczowy kompleks z maksimum absorpcji 450 nm[21]. W celu określenia zdolności przeciwutleniającej badanych surowców należy odnieść się do ilości równoważników kwasu moczowego w próbce. W tym celu sporządza się wykres zależności wartości absorbancji kompleksu z Cu(I), który w zakresie stężeń kwasu moczowego 0,05-2 mM ma przebieg prostoliniowy[22,1].

Warto wspomnieć, że popularną metodą określającą potencjał antyoksydacyjny surowców roślinnych jest metoda oznaczania całkowitej zawartości polifenoli. Metoda ta oparta jest na reakcji barwnej pomiędzy odczynnikiem Folina-Ciocalteau (F-C). Całkowitą zawartość związków polifenolowych ocenia się spektrofotometrycznie, a maksimum absorbancji obserwuję się przy długości fali 740 nm. Wyniki przedstawione są jako ilość równoważników substancji odniesienia, głównie do kwasu gallusowego[23]. Zaletą tej techniki jest duża prostota i użyteczność do standaryzacji materiałów biologicznych, wadą zaś mała specyficzność[24].

W powyższym artykule odniesiono się do kilku wybranych metod oceny właściwości antyoksydacyjnych, jakie mogą posiadać nie tylko ekstrakty roślinne, ale także inne próbki biologiczne. Metody te charakteryzują się dużą powszechnością w stosowaniu przez badaczy ze względu na prostotę w wykonaniu, szybki przebieg analizy czy ekonomiczność. Oczywiście należy pamiętać, że metody te nie są pozbawione wad i błędów. Wiele z nich jest w dalszym ciągu niedopracowanych, zaniedbujących szereg czynników mających wpływ na uzyskane wyniki. Ciężko jest więc stwierdzić, która z nich mogłaby być uznana za najbardziej optymalną. Niemniej jednak należy mieć na uwadze fakt, że surowce roślinne powinny być nieustannie poddawane ocenie przeciwutleniającej w celu badania ich pod kątem wykorzystania w produktach kosmetycznych chroniących skórę przed nadmiernym działaniem wolnych rodników.

Aleksandra Ziemlewska, Martyna Zagórska-Dziok
Katedra Technologii Produktów Kosmetycznych i Farmaceutycznych, Kolegium Medyczne,
Wyższa Szkoła Informatyki i Zarządzaniaw Rzeszowie

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Kosmetycznego" 4/2020