Mikrobiologiczne zanieczyszczenia kosmetyków drobnoustrojami niespecyficznymi – cz. I. Przegląd często występujących gatunków bakterii Gram-dodatnich

Kosmetyki to trudna matryca do badań. Niski poziom zanieczyszczenia, „zestresowane” komórki drobnoustrojów, problem z uzyskaniem jednorodnej zawiesiny oraz antybakteryjna aktywność produktu kosmetycznego utrudniają osiągnięcie czułości metody na odpowiednim poziomie. Dopiero wprowadzenie etapu neutralizacji środków konserwujących zawartych w kosmetykach w zweryfikowanych rozcieńczalnikach, jak i stosowanie odpowiednich czasów i temperatur inkubacji pozwala na wykrywanie nawet bardzo niskich poziomów zanieczyszczeń oraz izolację różnego rodzaju drobnoustrojów. Schemat identyfikacyjny zawarty w normie PN-EN – ISO 18415:2017-07 [14] podaje generalną ścieżkę określania przynależności do gatunku izolowanych mikroorganizmów w badanej próbce. Postępowanie obejmuje zarówno potwierdzenia mikroorganizmów specyficznych, jak i identyfikację drobnoustrojów niespecyficznych. W stosunku do drobnoustrojów niespecyficznych, po sprawdzeniu podstawowych cech identyfikacyjnych, takich jak morfologia komórek w preparacie mikroskopowym, ich podatność na barwienie metodą Grama, aktywność oksydazy oraz katalazy, polecany jest do stosowania albo odpowiednio dobrany panel biochemiczny, albo bardziej zaawansowane rozwiązania np. spektometria mas w technice MALDI TOF. Wynik wyrażany jest jako Obecny (nazwa gatunku i/lub podstawowa charakterystyka morfologiczna) w próbce S.

Prowadzone od wielu lat badania własne oraz dane literaturowe dotyczące skażeń mikrobiologicznych kosmetyków, jak i czystości mikrobiologicznej środowiska produkcji potwierdzają obecność drobnoustrojów nie tylko należących do gatunków określonych jako specyficzne. Poniżej zamieszczono przegląd pojawiających się gram-dodatnich drobnoustrojów niespecyfi cznych, sprawiających problemy w produkcji kosmetyków. Podane matryce, z których wyizolowano poszczególne gatunki pochodzą z badań własnych prowadzonych w ciągu ostatnich dwóch lat.

Drobnoustroje Gram-dodatnie to zróżnicowana grupa mikroorganizmów obejmująca zarówno ziarniaki np. z rodzaju Staphylococcus spp., Microccocus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., jak i laseczki przetrwalnikujące tlenowe (np. Bacillus spp.) lub beztlenowe (np. Clostridium spp.). Dużą grupę stanowią pałeczki, w tym te należące np. do rodzaju Listeria spp., Propionibacterium spp., Actinomyces spp., ale i Bifi dobacterium spp. czy Lactobacillus spp.. Wśród nich znajdują się zarówno saprofi ty, jak również drobnoustroje oportunistyczne i bezwzględnie chorobotwórcze. W mikrobiologii kosmetyków
mogą być izolowane drobnoustroje z każdej z tych grup.

Staphylococcus inne niż S. aureus Staphylocccus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri

Są to ziarniaki tworzące skupiska (grona), nieurzęsione, mogące wytwarzać otoczkę. Oksydazo-ujemne i katalazo-dodatnie. W odróżnieniu od S.aureus są koagulazo-ujemne i nie rozkładają mannitolu. Wchodzą w skład mikrobiomu skóry człowieka. Występują również na błonach śluzowych jamy ustnej i w drogach moczowo-płciowych (Staphylocccus epidermidis). To patogeny oportunistyczne wywołujące stany zapalne u osób o obniżonej odporności np. po ciężkiej infekcji, zabiegach inwazyjnych, chemioterapii czy transplantacji. Mogą powodować zapalenie wsierdzia, zakażenia skóry, zapalenie kości i szpiku kostnego, zakażenia układu moczowego, zapalenia rogówki oka a nawet sepsę [19]. Ich obecność w środowisku produkcji często wskazuje na nieprzestrzeganie zasad higieny przez personel. Staphylococcus epidermidis posiada dużą zdolność tworzenia biofilmu, trudno usuwalnego z zajętej powierzchni, powodującego wtórne zanieczyszczenie produktów. [3]

W badaniach własnych izolowane z próbek surowców jak i produktów gotowych, jak np. kremów do twarzy, żeli micelarnych, mydeł i szamponów.

Micrococcus luteus i Glutamicibacter creatinolyticus

Micrococus luteus to ziarenkowiec należący do rodziny Micrococcaceae, rodzaju Micrococcus spp. Tworzy tetrady lub nieregularne skupiska, nie wytwarza otoczki ani wici. Wykazuje metabolizm ściśle tlenowy. Oksydazo-dodatni i katalazo-dodatni. Nie fermentuje glukozy. Na pożywkach nieselektywnych rośnie w postaci kolonii o żółto-cytrynowej barwie [11]. W odróżnieniu od gronkowców jest oporny na furazolidon, co zostało wykorzystane w prostych testach różnicujących te dwa rodzaje rodziny Micrococcaceae. Nie ma wysokich wymagań odżywczych i nie jest wrażliwy na wysokie zasolenie. Występuje w wielu środowiskach naturalnych w tym w glebie, kurzu, w powietrzu i w wodzie ale i w mleku oraz jego przetworach. Podobnie jak gronkowce stanowi naturalną mikroflorę skóry i błony śluzowej człowieka oraz niektórych innych ssaków. Jest patogenem oportunistycznym mogącym wywołać wiele poważnych zakażeń u osób z obniżona odpornością [18].

Izolowany w badaniach środowiskowych z powietrza, wody, produktów gotowych np. z peelingu do ciała. Występowanie w produkcie może świadczyć o niedostatecznej higienie pomieszczeń produkcyjnych.

Glutamicibacter creatinolyticus, wcześniej określany jako Arthrobacter creatinolyticus, należy do rodzaju Arthrobacter spp. z rodziny Micrococcaceae. Pałeczki o nieregularnym kształcie, tlenowe, katalazo-dodatnie i oksydazo-dodatnie. Nieprzetrwalnikujące, nieruchliwe, hydrolizują kreatyninę. Na pożywce agarowej BHI mikroorganizm ten tworzy okrągłe, gładkie kolonie, zabarwione na kolor żółty. Izolowane ze środowiska np. z różnego typu gleby, wody i powietrza, próbek klinicznych ale i z żywności oraz roślin. Powszechność występowania w środowisku wynika z ich niskich wymogów żywieniowych jak i odporności na stres. W niewielu doniesieniach powiązany jest z infekcjami układu moczowego oraz bakteriemią [17]. W badaniach własnych izolowany z suszu roślinnego.

Bacillus inne niż Grupa B.cereus B. subtilis, B. altitudinis, B. amyloliquefaciens, B.simplex, B. pumilus, B. oceanisediminis, B. licheniformis.

Laseczki okrągło lub prosto zakończone. Urzęsione perytrychalnie lub biegunowo. Występują pojedynczo lub w długich rozgałęzionych formach. Oksydazo-dodatnie i katalazo-dodatnie. Nie fermentują mannitolu. Charakteryzują się metabolizmem tlenowym lub względnie beztlenowym [11]. Bardzo rozpowszechnione w przyrodzie. Bakterie te izoluje się z gleby, kurzu, każdego surowca roślinnego (szczególnie z tych zawierających dużą ilość skrobi i białka), sierści zwierząt, z wody i różnego rodzaju osadów. W warunkach tlenowych wytwarzają przetrwalniki (spory), które nawet w ekstremalnie trudnych warunkach potrafią przetrwać przez długi czas. Dotyczy to również powierzchni dezynfekowanych, gdzie pod wpływem stresu bakteryjnego mikroorganizmy te wytwarzają spory niewrażliwe na środki dezynfekcyjne. W środowisku wodnym dzięki regularnym kształtom potrafią łatwo utworzyć biofilm [3]. Wytwarzają wiele enzymów egzokomórkowych rozkładających białka np. α-amylazy, polisacharydy (rozkład skrobi do glukozy i utlenienie np. do kwasów organicznych) i lipidy. Wszystkie te cechy mogą powodować zmianę właściwości odżywczych produktów kosmetycznych, wady ich konsystencji i struktury oraz kłopoty z eliminacją tego drobnoustroju ze środowiska produkcji [12].

W związku z tym, że rozróżnienie gatunków B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens oraz B. pumilus na podstawie cech biochemicznych jest niemożliwe ze względu na ich bardzo bliskie pokrewieństwo, gatunki te tworzą tzw. grupę Bacillus subtilis.

B.subtilis B. licheniformis oraz B. amyloliquefaciens stosowane są w przemysłowej produkcji preparatów amylolitycznych [13]. Gatunek B. subtilis powoduje wady pieczywa tzw. śluzowacenie, ale również jest przedmiotem zainteresowania jako probiotyk. Szczep B.subtilis 2335 wyizolowany ze zwierzęcego układu pokarmowego wykazuje antagonistyczne działanie wobec ludzkich patogenów np. Campylobacter spp. oraz wytwarza substancję antybiotyczną (amicoumacynę) o aktywności in vitro przeciwko bakteriom H. pylori. Przetrwalniki B. subtilis stymulują produkcję naturalnych przeciwciał, pomocnych przy zapobieganiu i leczeniu długotrwałych zaburzeń jelitowych. B. subtlis 2335 mimo posiadania statusu GRAS nie jest powszechnie stosowany w preparatach probiotycznych. Zanotowano pojedyncze przypadki bakteriemii związanej ze spożywaniem probiotyku z tą bakterią [20]. Należy zaznaczyć, że przetrwalniki i formy wegetatywne szczepu B. pumilis odporne na działanie nadtlenku wodoru jak i promieniowanie UV, zostały wyizolowane z powierzchni oraz powietrza na pokładzie Międzynarodowej Stacji Kosmicznej [8]. W praktyce laboratoryjnej izolowane z próbek środowiskowych, surowców np. suszy roślinnych, kaolinu oraz produktów gotowych, jak np. kremów do ciała, kremów do twarzy, żeli micelarnych czy szamponów.

Brevibacterium spp.

Gram dodatnie, nieruchliwe drobnoustroje o zmiennej budowie od ziarniaków poprzez krótkie pałeczki lub maczugowce. Katalazo-dodatnie i oksydazo-dodatnie. Wykazują metabolizm tlenowy. Tolerują wysokie stężenie soli dochodzące nawet do 15% oraz odczyn zasadowy. Hydrolizują żelatynę. Nie rozkładają skrobi. Identyfikacja gatunkowa ulega zmianom zgodnie z nowymi ustaleniami taksonomicznymi. Izolowane ze środowiska, również ze środowiska morskiego (algi) jak i z produktów mlecznych (B.casei [5]. B.casei jak i B. epidermidis mogą być częścią fizjologicznej mikroflory skóry człowieka. Stanowią florę komensalną, ale mogą również być oportunistycznie patogenne i powodować zakażenia łącznie z sepsą [2]. W badaniach własnych izolowane z produktów gotowych: pudru i bronzera.

Lactobacillus plantarum

Mezofilna, nieprzewodnikująca pałeczka z rodzaju Lactobacillus spp. Mikroaerofilna, katalazo-ujemna, indolo-ujemna. Fakultatywnie heterofermentatywna. Powszechnie występuje w fermentowanych produktach roślinnych, choć została również wyizolowana z ludzkiej śliny i mikrobioty jelitowej. Może powodować psucie się żywności, np. mięsa, wina czy soku pomarańczowego. L.plantarum ma zdolności do wykorzystywania wielu cukrów, peptydów i wytwarzania większości aminokwasów. Dzięki produkcji dużej liczby białek powierzchniowych umożliwiających przyleganie, wykazuje zdolności agregacyjne oraz powinowactwo do różnego rodzaju powierzchni, a geny kodujące funkcje regulujące, ułatwiają przystosowanie do różnych warunków. Wszystkie te cechy pozwalają L. plantarum na wzrost w bardzo szerokim spektrum warunków środowiskowych i mogą powodować jego obecność w przestrzeni produkcyjnej.

Gatunek ten ma długie tradycje zastosowania w produktach spożywczych np. w przetworach z oliwek i produktach fermentowanych. Określone szczepy bakterii Lactobacillus plantarum wykorzystywane do produkcji probiotyków przywracają naturalny, właściwie funkcjonujący układ mikroflory jelitowej. Wytwarzając kwas mlekowy, obniżają pH w jelicie, w ten sposób utrudniając osiedlanie i namnażanie się drobnoustrojów patogennych [7, 16]. Zanotowano bardzo nieliczne doniesienia wiążące ten gatunek z infekcjami np. bakteryjne zapalenie wsierdzia [4]. W rutynowych badaniach wyizolowany z kremu do depilacji ciała.

Enterococcus fecalis i Enterococcus fecium

Paciorkowce o nieco owalnym kształcie, układające się w pary, łańcuszki lub nieregularne skupiska. Oksydazo-ujemne i katalazo ujemne, pyrazo-dodatnie. Względne beztlenowce. Rosną w temperaturze 45oC w obecności 6,5% NaCl i pH 9,0. Hydrolizują eskulinę i MUD. Wykazują zdolność do wzrostu na pożywkach selektywnych w obecności soli żółci, azydku sodu, octanu talu i kwasu nalidiksowego. Tworzą brązowo-czarne, błyszczące kolonie. Na pożywce z krwią wytwarzają hemolizę – E.feacalis: β lub ϒ, E. fecium: α lub ϒ [11]. Stosunkowo odporne na wysychanie, odczyn zasadowy i zasolenie. Wchodzą w skład naturalnej flory fizjologicznej jelit i jamy ustnej. Obecne są w dużych ilościach w ściekach oraz wodzie zanieczyszczonej ściekami lub kałem. Ich obecność stwierdzono również w glebie oraz roślinach. W porównaniu np. z E.coli charakteryzują się nieco dłuższą przeżywalnością w wodzie oraz większą odpornością na chlorowanie jak i działanie wysokiej temperatury (przeżywają 30 min w 60oC). Enterokoki jelitowe są drobnoustrojami wskaźnikowymi obecności patogenów kałowych w wodzie nieuzdatnionej, w wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi jako wskaźnik dodatkowy oprócz E.coli, w kontroli nowych systemów dystrybucyjnych oraz po ich naprawach. Ich obecność w wodzie świadczy o świeżym zanieczyszczeniu kałowym [9]. Nieliczne szczepy zarówno E. fecalis jak i E.feccium maja zdolność do tworzenia biofilmu [10].

Enterokoki są drugą pod względem częstotliwości występowania przyczyną zakażeń układu moczowego [1]. Są również czynnikiem etiologicznym takich chorób jak zapalenie wsierdzia, jamy brzusznej oraz sprawcą ogólnych zakażeń pooperacyjnych i szpitalnych bakteriemii [15]. Wszystkie enterokoki są naturalnie oporne na cefalosporyny i kotrimoksazol [6]. Od wielu lat narasta również problem nabytych odporności na antybiotyki przez szczepy Enterococcus spp.: oporność na wysokie stężenia antybiotyków aminoglikozydowych (HLAR), oporność na glikopeptydy (VRE) oraz oporność na linezolid (LRE). Izolowane z próbek środowiskowych i wody.

Powyższy przegląd niespecyficznych drobnoustrojów Gram-dodatnich izolowanych z zanieczyszczonych produktów kosmetycznych wskazuje na kilka wspólnych cech tych mikroorganizmów, zwiększających ryzyko ich występowania: powszechna obecność w środowisku naturalnym, w tym w glebie, niskie wymagania żywieniowe, odporność na warunki ekstremalne oraz zdolność do przylegania do różnych powierzchni i tworzenia biofi lmu. Ich obecność w produkcie wskazuje więc często na problemy z zakażeniami wtórnymi w czasie procesu produkcji lub z zanieczyszczeniem surowców pochodzenia roślinnego.

Określenie rodzaju ryzyka mikrobiologicznego związanego z całym procesem produkcji i dystrybucji produktu pozwoli na dobranie skutecznych narzędzi do jego minimalizacji. Zwalidowany i nadzorowany proces mycia i dezynfekcji środowiska produkcji, kontrola mikrobiologiczna surowców pochodzenia roślinnego, przestrzeganie zasad GMP wraz ze stałą kontrolą punktów krytycznych na etapie produkcji i dystrybucji to najlepszy sposób na zapobieganie zanieczyszczeń mikrobiologicznych produktu gotowego.

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Kosmetycznego" 4/2021